Preparação de uma Placa Microfluídica com Células Bacterianas

Resumo

Fonte: Sutlief, A. L., et al. Análise de Células Vivas do Estresse de Cisalhamento em Pseudomonas aeruginosa usando um sistema microfluídico automatizado de maior rendimento. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra a preparação de uma placa microfluídica para estudos de tensão de cisalhamento em culturas bacterianas. Após a preparação dos canais com meio, as células bacterianas são introduzidas no canal experimental e incubadas para a fixação. Meios residuais e culturas são removidos para preparar o sistema para experimentos subsequentes de tensão de cisalhamento.

Protocolo

1. Preparação para a Mídia

1. Prepare um substrato mínimo (MM) com 0,25% de glicose. Para produzir 1 L de MM com 0,25% de glicose, adicione 200 mL de solução estéril de sal M9, 2 mL de sulfato de magnésio estéril de 1 M (MgSO₄), 100 μL de cloreto de cálcio estéril de 1 M (CaCl₂) e 12,5 mL de glicose estéril de 20% (p/v) em água (_{dH 2}O) em volume final de 1 L.
2. Transfira o meio necessário para um frasco estéril usando técnicas estéreis. Prepare a quantidade necessária dependendo do número de canais utilizados. Tipicamente, cada canal requer 200 μL para preparação, 300 μL para semeadura e 1300 μL para o experimento de 24 horas.
3. Coloque a garrafa em uma incubadora ou banho-maria ajustada à temperatura experimental. O meio deve estar na temperatura do experimento antes do uso para evitar a formação de bolhas nos microcanais.

2. Preparação de uma cultura noturna e experimental da cepa PA01 de Pseudomonas aeruginosa que expressa uma proteína fluorescente verde aprimorada (PA01-EGFP).

1. Coloque 15 mL de meio experimental em um frasco estéril e inocule com uma ou duas colônias de uma placa de ágar riscada com PA01-EGFP. Expanda a cultura por 12-16 horas em uma incubadora/mesa agitadora a 37 °C e 180-220 rpm.
2. Meça o OD₆₀₀ da cultura da noite para o dia. Quando o OD₆₀₀ for maior que 0,80, dilua a cultura durante a noite até um OD final de 0,8 usando MM fresco. Coloque a cultura experimental em uma incubadora ou banho-maria a 37 °C até que seja necessário para semear os canais microfluídicos. Verifique o OD₆₀₀ novamente imediatamente antes da semeadura para garantir que ele não mudou significativamente em relação ao alvo OD₆₀₀, 0,8 neste caso.

3. Inicialização de Equipamentos

1. Configure a estação de sistema de acordo com o guia do usuário, semelhante à configuração da Figura 1. Para evitar um erro na conexão do instrumento ao software, ligue-o na seguinte ordem:
   Estação de Trabalho PC
   Módulo de Fluorescência. Certifique-se de que o obturador de fluorescência esteja LIGADO (luz azul ao lado do botão do obturador ligado)
   Controladores de Hardware
   Controlador do sistema de imagem (veja Tabela de Materiais)
   Câmera CCD
   Estação de Imagem (Microscópio)
   NOTA: A temperatura da placa aquecida deve ser ajustada para a temperatura experimental desejada.
2. Inicie a aplicação de controle e insira o número da placa localizado na etiqueta na lateral da placa.
   NOTA: Após o início do aplicativo de controle, haverá duas janelas separadas de aplicação, uma para o software que controla o microscópio/software de imagem e outra para o módulo de controle que controla a bomba e a interface da placa do poço.

4. Preparação e semeadura da placa microfluídica

NOTA: A priming, a semeadura, a fixação bacteriana e o crescimento estão ilustrados na Figura 2.

1. Remova a placa microfluídica de 48 poços da embalagem, tomando cuidado para não tocar na superfície do vidro na parte inferior da placa. Limpe bem o lâmina de vidro na parte inferior da placa com um papel de lente, um pano sem fiapos ou um lenço de baixa pressão.
2. Para preparar os canais microfluídicos, pipete-se 200 μL de 37 °C MM no poço de saída, tomando cuidado para evitar bolhas. Coloque a placa no estágio de placa e limpe a interface com etanol, deixando secar, antes de selá-la no estágio de placa.
3. No modo Manual no módulo de controle, defina Fluido como
   luria-bertani (LB) a 37 °C e Cisalhamento Máximo a 5,00 dyne/^{cm 2}. Clique nos poços de saída para ativar o fluxo da saída para o poço de entrada, preparando os canais. Após os 5 minutos de preparação, pause o fluxo para preparar a semeadura. Remova cuidadosamente a placa do palco e a pipete o meio residual da saída, mas não remova nenhum material do meio do círculo interno que leva aos canais microfluídicos.
4. Para semear os canais experimentais, primeiro pipete 300 μL de MM no poço de entrada, seguido pela pipete de 300 μL da cultura bacteriana no poço de saída dentro do poço de saída. Coloque a placa de volta na etapa da placa, certificando-se de limpar a interface antes de colocá-la na placa.
5. No Módulo de Controle, foque em um único canal usando o feed da câmera ao vivo após colocar o estágio de placas sobre o palco do microscópio. Durante o monitoramento visual pelo feed ao vivo, retome o fluxo entre 1,00-2,00 dyne/cm² por aproximadamente 2-4 s para permitir que as células entrem no canal experimental, mas não nos canais serpentinos. Deixe a placa no estágio de temperatura controlada por 1 hora para permitir a fixação da célula. Durante a incubação de 1 hora, o Módulo de Controle e o software de montagem podem ser configurados para o autorun.
   NOTA: O tempo necessário para a semeadura varia conforme o meio e o organismo, portanto, deve ser monitorado de perto pela transmissão ao vivo até ser otimizado e usado como um período geral. A semeadura ao longo da placa pode variar, o que exigiria mais tempo para que a aplicação fluísse para certas colunas de canais para a semeadura completa.
6. Após o período de fixação, remova suavemente a placa do palco e pipete as bactérias da saída primeiro, evitando perturbar o canal. Com uma nova ponta de pipeta, remova o meio dos poços de entrada.

Resultados

Figura 1: Componentes individuais do Sistema Microfluídico. Os componentes individuais são listados da esquerda para a direita: 1. Câmera CCD, 2. Microscópio Invertido de Alta Resolução com Estágio Automatizado, Módulo de Fluorescência Auto...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cloreto de Amônio, ACS	VWR	BDH9208-500G	Parte da composição mínima de mídia
BioFlux 1000 48 poços com placa de cisalhamento baixa	Fluxion Biosciences	910-0047
Sistema de Imagem Microfluídico BioFlux 1000Z	Fluxion Biosciences	BF 1000Z
Di-hidreto de Cloreto de Cálcio, Grau ACD	VWR	97061-904	Parte da composição mínima de mídia
Dextrose, Anidro, ACS	VWR	BDH9230-500G	Parte da composição mínima de mídia
Sulfato de Magnésio Grau ACS	VWR	EM-MX0070-1	Parte da composição mínima de mídia
Fosfato de potássio monobásico, grau ACS	VWR	BDH9268-500G	Parte da composição mínima de mídia
Pseudomonas Aeurginosa GFP	ATCC	15692GFP	Cepa bacteriana de Pseudomonas aeurinosa PA01 com modificação por GFP foi usada neste estudo.
Cloreto de Sódio, ACS	VWR	BDH9286-500G	Parte da composição mínima de mídia
Fosfato de sódio, monobásico, anidro, grau reagente	VWR	97061-942	Parte da composição mínima de mídia