Modelo in vitro de fluxo paralelo de placas para estudar a adesão bacteriana em biópsia de tecido

Resumo

Fonte: Ditkowski, B., et al. Um modelo in vitro de um sistema de perfusão de placas paralelas para estudar a adesão bacteriana a tecidos de enxerto. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra o método de usar uma câmara de fluxo de placas paralelas para perfundir bactérias marcadas fluorescentemente sobre tecidos de enxerto vascular, permitindo uma análise controlada da adesão bacteriana e da patogênese precoce sob condições de fluxo de cisalhamento.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de ética animal apropriado.1. Experimentos de Perfusão In Vitro usando uma Câmara de Fluxo de Placas Paralelas

1. Monte biópsias de tecido de 10 mm de diâmetro e mesma espessura em um sistema de câmara de fluxo com a superfície interna voltada para cima para entrar em contato com a suspensão bacteriana.
   NOTA: A mesma espessura de tecido em vários enxertos garante que a mesma altura do tecido seja atingida no canal, permitindo o fluxo laminar em todas as condições. Todos os elementos da câmara de fluxo são apresentados e descritos na Figura 1.
   1. Para iniciar o protocolo, coloque a peça redonda de tecido entre uma lâmina de microscópio com perfuração circular de 8 mm e uma junta de borracha.
      NOTA: A lâmina do microscópio possui o filme inferior ultrafino para permitir a geração do furo de 8 mm. Junto com a folha de borracha, fixa o tecido para permitir o contato direto entre a amostra e o meio em movimento e também evita a luxação da biópsia durante o experimento. A superfície do tecido investigado, que está exposta ao fluxo (diâmetro menor), não pode ser manipulada pelas pinças.
      1. Insira o suporte com o papel de papel na chapa de junta embutida na estrutura metálica inferior da câmara.
      2. Fixe a estrutura metálica superior com a chapa de junta correspondente na parte inferior da câmara com o suporte de papel previamente inserido. Em seguida, monte toda a câmara com oito parafusos e porcas de parafuso. Certifique-se de que a altura da câmara seja sempre a mesma entre os enxertos.
         NOTA: A altura da câmara deve ser sempre determinada ao apertar os parafusos. Use um calibre ou régua.
2. Conecte a câmara de fluxo com uma bomba peristáltica e o reservatório de fluido com os tubos.
3. Perfunda os tecidos com suspensões de 10 CFU^/ mL (verificada por contagem de CFU (unidade formadora de colônia) e relacionada às medições OD₆₀₀ (densidade óptica)) em PBS (soro tampão fosfatado) com tensão de cisalhamento de 3 dyne/cm² (dyne por unidade de pressão centímetro quadrado) por meio da bomba peristáltica (vazão 4 mL/min) por 1 h, usando um reservatório bacteriano de 400 mL (projeto interno, Figura 1) condicionado a 37 °C usando um termostato de placa (Tabela de Materiais).
4. Recircule continuamente a suspensão bacteriana de 100 mL usando o mesmo reservatório de coleta.
5. Após a perfusão, desmonte a câmara para liberar o enxerto e lave o pedaço de tecido duas vezes com 4 mL de PBS em uma placa de 12 poços usando o agitador orbital do laboratório por 3 minutos cada. Posteriormente, corte a parte interna do enxerto usando um punção de biópsia cutânea de diâmetro menor.
6. Coloque cada biópsia de tecido em um tubo separado de 14 mL contendo 1 mL de NaCl estéril 0,9%. Rotule o tubo como #1.
7. Separe as bactérias do tecido usando um banho de sonicação por 10 minutos (amplitude = 100% e frequência = 45 kHz).
   NOTA: O descolamento total das bactérias dos enxertos de tecido deve ser avaliado após a incubação dos adesivos durante a noite a 37 °C em meio líquido TSB (caldo de soja tríptico), seguido de medições de OD₆₀₀ em comparação com adesivos controle tratados com solução livre de bactérias.

Resultados

Figura 1: Imagem de um sistema de câmara de fluxo recém-desenvolvido (projeto interno). A. O conjunto de fluxo montado na câmara de fluxo (1) de dimensões LxLxH: 125 mm x 55 mm x 18 mm (parafusos em combinação com porcas de parafuso mantêm ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Patch de Pericárdio Bovino (BP), Pericárdio Supple Peri-Guard	Synovis Surgical Innovations, EUA	PC-0404SN
Condutos da veia jugular bovina (BJV)	conduto Contegra; Medtronic Inc, EUA	M333105D001
Homoenxerto criopreservado CH	Banco Europeu de Homoenxerto (EHB)	-
Acu-Punch	Acuderm Inc, EUA	P850 (8 mm); P1050 (10 mm)
Albumina Humana	Flexbumin; Baxter, Bélgica	BE171464LOT:16G12C
Caldo de soja tríptico (TSB)	Fluka, Steinheim, Alemanha	22092-500G
Caldo de infusão para o coração (BHI)	Fluka	53286-500G
Soro salino tamponado com fosfato (PBS).	Gibco	14190-094
5(6)-Éster de N-hidroxisuccinina (FC) de carboxifluoresceína	Sigma-Aldrich, Alemanha	21878-100MG-F
Bomba peristáltica (MODELO ISM444B)	Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Alemanha	631942-2
Banho de sonicação	Purificador Ultrassônico VWR; VWR, Radnor, Pa	142-6044	230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W
Montagem ProLong Gold Antifade	Invitrogen por ThermoFisher	P36930
Arium Pro VF - água ultrapura - H2O MilliQ	Millipore	87206462
Lâminas microscópicas - Câmaras de Cultura de Tecidos (1-poço)	Sarstedt	94.6140.102
1-poço no Lumox destacável	Sarstedt	94.6150.101
Aço inoxidável - lâminas cirúrgicas	Swann-Morton	311
Tubo de silicone Tygon, 1/8" de DIÂMETRO x 1/4" de Diâmetro	Cole-Parmer	EW-95702-06	Faixa de temperatura: –80 a 200°C Esterilize: Com óxido de etileno, irradiação gama ou autoclave por 30 min, 15 psi de pressão
Tubagem BPT PharMed	Saint-Gobain	AY242012	Autoclavável 30 min a 121°C
Tubo Tygon LMT-55	Saint Gobain Performance Plastics™	15312022
Termostato	BMG BIOMEDIZINTECHNIK	300-0042	230V, 90VA, 50Hz