Um ensaio in vitro para estudar interações microbianas em co-cultura

Resumo

Fonte: Temkin, M. I. et al. Ensaios de Cocultura de Alto Rendimento para a Investigação de Interações Microbianas. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra um ensaio in vitro para estudar interações microbianas entre Corynebacterium propinquum e Staphylococcus em uma cocultura.

Protocolo

1. Inoculação de Organismo-Alvo

NOTA: Após a incubação durante a noite, certifique-se de que as culturas estejam turvas. Algumas culturas bacterianas podem flocular no fundo do tubo de cultura. Faça vórtice nos tubos de cultura para dispersar os aglomerados e avaliar a turbidez da cultura.

1. Prepare a placa-alvo enchendo cada poço de uma placa vazia de 12 poços com 1,8 mL de caldo de infusão Brain-heart (BHI) e 200 μL da cultura de uso noturno alvo.
   NOTA: Um organismo-alvo refere-se ao organismo cujo status de inibição é determinado usando o ensaio de interação de cocultura. Para este experimento, os organismos-alvo são Staphylococcus spp. isolados de amostras de lavagem nasal humana.
2. Desembrulhe e coloque um carimbo de inoculação estéril na placa-alvo. Gire suavemente as culturas nos poços, tomando cuidado para que as culturas não contaminem poços vizinhos.
3. Levante o carimbo de inoculação e certifique-se de que haja uma gota de cultura alvo diluída em cada ponta do carimbo.
4. Prepare uma placa de controle de monocultura colocando o carimbo de inoculação em uma placa de bioensaio não inoculada e balance suavemente o carimbo para que uma gota de cultura inocule cada poço. Uma vez removido o carimbo de inoculação, uma gota de cultura deve ser visível nos poços da placa de bioensaio.
   1. Se algum poço não for inoculado com o carimbo de inoculação devido a níveis desiguais de meio, coloque 3 μL de cultura diluída durante a noite no lado direito dos poços usando uma pipeta.
5. Inocule as placas de bioensaio como feito acima (veja o passo 1.4.1), mas alinhe o carimbo de modo que as pontas fiquem alinhadas com o lado direito da placa de 12 poços. Certifique-se de que o carimbo não entre em contato com a colônia bacteriana existente ao inocular os poços.
6. Remova cuidadosamente o carimbo e coloque-o de volta na placa de alvo.
7. Repita a inoculação para cada placa de bioensaio até que todas as placas estejam inoculadas.
8. Incube as placas de bioensaio de cabeça para baixo na temperatura adequada por 7 dias.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de cultura celular de 12 poços, estéril com tampa	Greiner bio-one	665 180
Ágar, bacteriológico	VWR	J637
Caldo de Infusão Cérebro-Coração	Dot Scientific	DSB11000-5000