Este protocolo descreve um procedimento para estudar a respiração das mitocôndrias isoladas dos músculos esqueléticos. Este método foi adaptado de Scorrano Et al. (2007). O procedimento de isolamento mitocondrial requer cerca de 2 horas. A respiração mitocondrial pode ser concluído em cerca de 1 hora.
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Artigo de método
Isolamento mitocondrial do músculo esquelético
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
As mitocôndrias são organelas controlar a vida ea morte da célula. Eles participam nos principais reações metabólicas, sintetizar a maior parte do ATP, e regular uma série de cascatas de sinalização 2,3. Pesquisadores passadas e actuais, mitocôndrias isoladas de ratos e camundongos tecidos como fígado, cérebro e coração 4,5. Nos últimos anos, muitos pesquisadores se concentraram em estudar a função mitocondrial dos músculos esqueléticos.
Aqui, descrevemos um método que temos utilizado com sucesso para o isolamento de mitocôndrias de músculo esquelético 6. Nosso procedimento requer que todos os tampões e reagentes são feitas fresco e precisa de cerca de 250-500 mg de músculo esquelético. Foram estudadas mitocôndrias isoladas de ratos e camundongos gastrocnêmio e diafragma e os músculos extra-oculares de ratos. Concentração de proteína mitocondrial é medido com o ensaio de Bradford. É importante que as amostras mitocondrial ser mantida gelada durante a preparação e que estudos funcionais ser realizada dentro de um prazo relativamente curto (~ 1 hr). Respiração mitocondrial é medida usando polarografia com um eletrodo do tipo Clark (sistema Oxygraph) a 37 ° C 7. Calibração do eletrodo de oxigênio é um passo fundamental neste protocolo e deve ser realizada diariamente. Mitocôndrias isoladas (150 mg) são adicionados a 0,5 ml de tampão experimental (EB). Estado respiração 2 começa com adição de glutamato (5mM) e malato (2,5 mM). Então, difosfato de adenosina (ADP) (150 mM) é adicionado para começar estado 3. Oligomicina (1 mM), um bloqueador sintase ATPase, é usado para estimar o estado 4. Por último, carbonil cianeto de p-[trifluoromethoxy]-fenil-hidrazona (FCCP, 0,2 mM) é adicionado à measurestate 5, ou não atrelados a respiração 6. A relação de controle respiratório (RCR), a relação entre o estado 3 para o estado 4, é calculado depois de cada experimento. Um RCR ≥ 4 é considerado como evidência de uma preparação de mitocôndrias viáveis.
Em resumo, apresentamos um método para o isolamento de mitocôndrias viáveis a partir de músculos esqueléticos que podem ser usadas em bioquímica (por exemplo, atividade enzimática, imunodetecção, proteômica) estudos e funcionais (respiração mitocondrial).
Protocolo
1. Preparação de Buffers
- Ligue 5804R centrífuga e definir a 4 ° C. Ligue Isotemp banho de água 3006D e definida para 37 ° C.
- Preparar as soluções seguintes antes de isolamento muscular:
- PBS: Dissolver tampão fosfato salino (PBS) comprimidos em água destilada (5 comprimidos / litro). Misture bem.
- PBS acrescido de 10 mM EDTA: Para preparar uma solução de 100 ml, adicionar 2 ml de 500 mM EDTA a 98 ml de PBS.
- Buffer de mitocôndrias 8X: 10,28 g de sacarose para uma concentração final de 0,6 M, 400 mg de ácido graxo livre-albumina sérica bovina (BSA) para uma concentração final de 0,8%, 2,08 g de HEPES para uma concentração....
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Discussão
Nós apresentamos um protocolo para isolar mitocôndrias viáveis do músculo esquelético. Se o rendimento é um problema, o protocolo pode ser modificada, incubando o músculo isolado em 5 ml de tripsina EDTA/0.01 PBS/10mM% por 30 minutos em gelo. Para assegurar a digestão muscular completo com tripsina, o músculo precisa ser totalmente picada. Após a incubação de 30 minutos, a solução de tripsina PBS/10mM EDTA/0.01% deve ser completamente substituído com 3 ml de isolamento tampão 1 (IB1). Além disso, o uso de tripsina pod.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por uma concessão do National Eye Institute (R01 EY12998) para FH Andrade.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 95% CO2 / 5% O2 mistura | Fornecedor Local de Gases | ||
| Sal sódico do adenosina 5′-difosfato | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Papel Blue Rizla | Hansatech | 890101 | |
| Ensaio de proteína Bradford | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Carbonylcyanide p-trifluorometoxifenil-hidrazona (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Centrífuga 5804R | Eppendorf | ||
| Nitrogênio comprimido | Fornecedor Local de Gases | ||
| D-manitol | Sigma-Aldrich | M9647 | |
| Ácido etilenoglicol-bis-tetraacético (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) | Bio-Rad | 161-0728 | |
| Albumina sérica bovina com ácidos graxos livres | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| Ácido glutâmico | Sigma-Aldrich | G5889 | |
| Sal sódico do HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Isotemp 3006D | Fisher Scientific | ||
| Cloreto de magnésio | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Ratos machos Sprague Dawley | Harlan Laboratories | 300-500g | |
| Ácido málico | Sigma-Aldrich | M9138 | |
| Minifuge | ISC Bioexpress | C1301P | |
| Oligomicina | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Disco do eletrodo de oxigênio | Hansatech | S1 | |
| Oxigrafo | Hansatech | ||
| Software Oxygraph Plus V1.01 | Hansatech | ||
| Medidor de pH | Mettler Toledo | 1225506149 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Cloreto de potássio | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Fosfato de potássio | Sigma-Aldrich | P8416 | |
| Homogeneizadores Potter-Elvehjem | Fisher Scientific | 08-414-14A | |
| Membrana de PTFE (0,0125 mm × 25 mm) | Hansatech | S4 | |
| Broca SKIL 3320 | Loja de ferragens | ||
| Sacarose | Sigma-Aldrich | S5016 |
Referências
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Duchen, M. R. Roles of mitochondria in health and disease. Diabetes. 53, Suppl 1. S96-S....
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Reimpressões e permissões
