Este vídeo mostra uma técnica eficaz para diferenciar e dissecando os vários semi-transparente das estruturas do corpo humano na pós vítreos olhos mortem.
Artigo de método
Dissecção da Human Elements Corpo Vítreo para Análise Proteômica
Neste artigo
Resumo
Resumo
O vítreo é uma opticamente clara, matriz extracelular de colágeno, que preenche o interior do olho e recobre a retina. 1,2 interações anormais entre subestruturas vítreo e da retina subjacentes várias doenças vítreo-retinianas, incluindo rasgaduras da retina e descolamento, pucker macular, buraco macular, idade degeneração macular relacionada à tração vítreo, Vitreorretinopatia proliferativa, retinopatia diabética proliferativa, e vitreoretinopathies herdada. 1,2 A composição molecular do vítreo subestruturas não é conhecido. Desde que o corpo vítreo é transparente com acesso cirúrgico limitado, tem sido difícil de estudar suas subestruturas no nível molecular. Desenvolvemos um método para separar e preservar estes tecidos para análise proteômica e bioquímica. A técnica de dissecção neste vídeo experimental mostra como isolar base vítrea, hialóide anterior, o núcleo vítreo, e no córtex vítreo dos olhos pós-morte humana. Unidimensional SDS-PAGE análises de cada componente do vítreo mostrou que a nossa técnica de dissecção resultou em quatro perfis de proteína única correspondente a cada subestrutura do corpo vítreo humano. Identificação de proteínas diferencialmente compartimentada irá revelar as moléculas candidato subjacente várias doenças vítreo-retinianas.
Protocolo
1. A dissecção do segmento anterior.
- A córnea é removida por primeiro fazer uma incisão no limbo dentro da câmara anterior utilizando uma lâmina de 15 ° (Figura 1). Em seguida, uma lâmina curvada de córnea escleral-tesoura é inserida dentro da câmara anterior. Circunferencial cortes são feitos na córnea, apenas anterior ao limbo.
- 0,12 Colibri pinças e tesoura Westcott são usados para cortar a íris circunferencialmente anterior ao corpo ciliar.
- O núcleo da lente foi removida com fórceps 0,12 Colibri ou uma lâmina de 15 ° (supersharp) e do córtex e da cápsula com uma pinça.
2. Aspiração Central vítreo.
- Uma agulha 23 gauge em uma seringa de 5 cc é inserido em meados da década de vítreo (Figura 1).
- Aproximadamente 1 mL ou mais do núcleo vítreo é suavemente aspirado.
- A amostra é então colocada em um tubo de microcentrífuga e depois em nitrogênio líquido.
3. Dissecação hialóide anterior.
- A hialóide anterior é visto como um anel semi-transparente, ajustando a luz incidente de um microscópio de luz ganso pescoço. Aspiração anteriores do núcleo vítreo se separa da hialóide anterior de outras estruturas para facilitar a identificação.
- A folha de tecido elástico é cuidadosamente puxado para longe do corpo ciliar com Colibri ou fórceps vestir-se e cortou com uma tesoura Vannas. Esta manobra é repetida.
- A amostra é então colocada em um tubo de microcentrífuga e depois em nitrogênio líquido.
4. Dissecção da Base vítreo.
- Usando 0,12 fórceps para estabilizar a taça do olho, uma tesoura Westcott são usados para "flor" o olho fazendo quatro igualmente espaçados de aliviar o stress cortes do corpo ciliar em direção à cabeça do nervo óptico.
- A pars plicata do corpo ciliar (Figura 2) é removida de cada um dos quadrantes usando uma tesoura Westcott.
- A base vítrea é, então, agarrou em ambos os lados da ora serrata com uma pinça sobre o pars plana e retina (Figura 2).
- Tração contínua sobre a base vítrea é aplicada com a pinça. Corte sequencial com tesoura Westcott extrai um tecido semi-transparente com um "colar de pérolas" aparência como é extirpado.
- A amostra é então colocada em um tubo de microcentrífuga e depois em nitrogênio líquido.
5. Remoção Cortex vítreo.
- A pars plana é retirado de cada um dos quadrantes com tesoura Westcott cortando o folheto aproximadamente 3 mm posterior à ora serrata (Figura 2).
- Entre os folhetos de tecido, o córtex do vítreo é visualizado como um filme semi transparente.
- O filme elástico ou é apreendido com 0,12 forceps ou detidos pela adesão a uma esponja Weck-Cel cirúrgico. O córtex vítreo é, então, afastou-se da retina e retirado com tesoura Westcott (Figura 1).
- A amostra é colocada em um tubo de microcentrífuga e depois em nitrogênio líquido. Todas as amostras são armazenadas a -80 ° C até utilizados para a experimentação.
6. Resultados representante
Amostras de tecido pode ser processado por uma variedade de métodos para experimentos específicos. No nosso caso, as amostras foram submetidas a análise de proteínas por SDS-PAGE (Figura 3).
Figura 1. Transversal visão do olho humano representando subestruturas diferentes do corpo vítreo. O vítreo mais anterior é uma fina camada de colágeno chamado de hialóide anterior. O núcleo vítreo compreende toda a região central do corpo vítreo. Esta parte do vítreo é mais aquosa em contraste com a base vítrea, que é viscoso o suficiente para ser captado por uma pinça e está firmemente ligado ao corpo ciliar e retina subjacente. Abrangendo o núcleo vítreo é um shell muito finas de colágeno chamada córtex vítreo.
Figura 2. Anatomia base vítrea. A base do vítreo é uma infra-estrutura semi-transparente do corpo vítreo localizado junto à ora serrata (setas brancas), que é a linha divisória que separa o corpo ciliar e retina. A borda anterior da base do vítreo se estende sobre a pars plana (linha branca) do corpo ciliar. A borda posterior da base vítrea estende 2-3 mm posterior à ora serrata (traço branco). Para extirpar a base do vítreo, uma pinça são usados para captar o tecido e puxe-o para longe do corpo ciliar e retina subjacente. Uma vez elevado, tesoura Westcott são usados para cortar ao longo da base.
Figura 3. Unidimensional SDS-PAGE de elementos do corpo vítreo. Concentrações de proteína total para a hialóide anterior, base vítrea, vitreous núcleo e córtex vítreo foram 11,24, 20,1, 16,61, 14,24 mg / mL, respectivamente. Eletroforese em gel foi realizada em 200 kV por 45 minutos, corados com Flamingo (Bio-Rad), e visualizados através de um VersaDoc Imaging System (Bio-Rad). Os perfis para os diferentes tecidos mostrar várias bandas similares, indicando quer conservada ou cross-contaminação proteínas, bem como as bandas originais (asterisco), indicando proteínas diferencialmente localizada.
Discussão
O corpo vítreo é um gel semi-transparente, cuja composição molecular é mal compreendida, especialmente no nível de suas subestruturas: a base do vítreo, núcleo, córtex, e hialóide anterior. O núcleo vítreo contém colágenos II, V, IX e XI, juntamente com proteoglicanos sulfato de condroitina, sulfato de heparan proteoglicanos, e. Hyaluronan 1,2 biomarcadores de proteína no núcleo vítreo têm sido associadas a doenças como a retinopatia diabética. 3-5 Como estas proteínas são diferencialmente expressos em cada uma das subestruturas, e em muitos casos, as identidades de proteínas específicas, não são conhecidos. Estas informações podem dar uma visão sobre a origem de proteínas associadas com certas doenças vítreo-retinianas e ajudar a futuras terapias-alvo. Embora o ideal intervalo post mortem para dissecção dos tecidos não foi determinado, a degradação de proteínas pode afetar experimentos a jusante. Por exemplo, imuno-histoquímica é afetado nos olhos de 12 horas pós-morte e algumas atividades de enzima específica pode ser reduzida dentro de algumas horas (observação não publicada). Todos os tecidos no presente estudo foram coletados entre 2 e 8 horas de morte, sem mudanças significativas na expressão da proteína ou da aptidão para analsyis proteômica. O método de congelamento de nitrogênio líquido de preservação é escolhido em detrimento de fixação para evitar pequenas mudanças na estrutura da proteína causada por fixador reticulação, que tem sido demonstrada em outros tecidos por LC-MS/MS. 6 estudos Proteômica dependerá da capacidade de precisão dissecar os diferentes compartimentos do vítreo, como demonstrado nesta experiência de vídeo. Temos validou a técnica de dissecção utilizando 1-dimensional SDS-PAGE. Como nossos resultados sugerem, existem proteínas diferencialmente expressos no corpo várias subestruturas vítreo. A identificação dessas proteínas irá fornecer uma compreensão mais detalhada de compartimentalização vítreo.
Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
O financiamento foi fornecido pelo Fight for Sight. Tecidos foram obtidos do Banco de Olhos Lions Iowa.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome | Companhia | Número de catálogo | |
| 0,12 forceps | Storz Ophthalmics | E1502 | |
| 5 cc-seringa | Becton-Dickinson | 309603 | |
| Pinça reta vestir Com serrilhas | Storz Ophthalmics | E1400 | |
| Agulha de calibre 23 | Becton-Dickinson | 305145 | |
| Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2 / 132 | |
| Castroviejo em ângulo tesoura de córnea | Storz Ophthalmics | E3223 | |
| Vannas Curved Tesoura Capsulotomia | Storz Ophthalmics | E3387 | |
| Weck-Cel cirúrgica lanças | Medtronic | 0008680 | |
| Westcott Curved Tesoura Tenotomia | Storz Ophthalmics | E3320 |
Referências
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Prog Retin Eye Res. 19, 323-344 (2000).
- Sebag, J. Molecular biology of pharmacologic vitreolysis. Trans Am Ophthalmol Soc. 103, 473-494 (2005).
- Yoshimura, T. Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases. PLoS One. 4, e8158-e8158 (2009).
- Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P., Feener, E. P. Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy. J Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).
- Izuta, H. Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients. Mol Vis. 15, 2663-2672 (2009).
- Azimzadeh, O. Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics. J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).
Reimpressões e permissões
