Avaliação da Inibição da Disseminação Viral por meio do Silenciamento Genômico Mediado por Mímicos de microRNA

Resumo

Fonte: Ruiz, A. J. e Russell, S. J. Regulação baseada em microRNA da tropismo de Picornavírus. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra o uso de miméticos sintéticos de microRNA para inibir seletivamente a replicação viral em células epiteliais cultivadas. Destaca como o silenciamento direcionado do genoma por microRNA pode bloquear a disseminação do vírus e confirmar a especificidade do direcionamento por meio de análise da infectividade subsequente.

Protocolo

1. Avaliação da Especificidade de Alvos de microRNA: Ensaio de Disseminação Viral Utilizando Miméticos Sintéticos de microRNA

NOTA: O uso de um mimético de microRNA sintético é realizado para demonstrar a especificidade da interação microRNA:microRNA-alvo.

1. Inclua controles de transfeção mock, controle negativo com mimetizador de microRNA e apenas controle com mimetizador de microRNA experimental em cada ensaio para avaliar a toxicidade mediada por microRNA. Também é ideal incluir um controle positivo (ou seja, gene ou genoma alvo do microRNA), pois baixa eficiência de transfeção dos mimetizadores de microRNA pode resultar em falsos negativos.
2. Plaque células H1-HeLa em uma placa de cultura tecidual de 96 poços de modo que estejam 80-90% confluentes no momento da transfeção (24 h após semeadura). Plaque as células em DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco) suplementado com 10% de soro bovino fetal, utilizando 0,1 mL por poço.
   NOTA: Realize este ensaio em células permissivas para replicação viral que não expressem os microRNAs cognatos.
3. Aqueça os reagentes de transfeção à temperatura ambiente. Combine 9 µL de meio sem soro, estoque de mimetizador de microRNA em concentração final de 200 nM por poço, 0,18 µL de reagente potencializador, 0,18 µL de reagente de transfeção e misture. Incube a mistura à temperatura ambiente por 2-5 min.
   NOTA: Os volumes listados são por poço. Recomenda-se preparar uma mistura-mestre para a transfeção de todos os poços, a fim de manter a consistência e minimizar erros de pipetagem. A concentração ideal do mimetizador de microRNA pode variar. Consulte as instruções do fabricante fornecidas com o mimetizador de microRNA para obter uma concentração inicial adequada. Geralmente, essa concentração varia entre 5 e 200 nM.
4. Aspire o meio dos poços e adicione 92 µL de meio completo fresco.
   NOTA: Se houver um número significativo de amostras, realize este passo antes de preparar a solução de transfeção e mantenha a placa a 37 °C até o momento adequado.
5. Adicione toda a mistura de transfeção às células gota a gota.
6. Incube a 37 °C por 6 h.
7. Infecte cada poço com uma baixa MOI (multiplicidade de infecção) para garantir que uma baixa porcentagem de células seja infectada, permitindo a análise da disseminação viral. Este protocolo utiliza uma MOI de 0,2.
   1. Dilua os estoques virais em meio sem soro até uma concentração de MOI = 0,2 por 100 µL. Remova o meio dos poços e adicione 100 µL da diluição viral por poço.
   2. Incube a 37 °C por 2 h.
8. Aspire o meio de cada poço e adicione 100 µL de meio completo fresco.
9. Incube a 37 °C por 20-22 h.
10. Determine a titulação viral nos sobrenadantes.
    1. Colete o sobrenadante de cada poço e substitua por 100 µL de meio completo fresco.
       NOTA: Se estiver usando células em suspensão, re-suspenda o pellet celular do passo seguinte em 100 µL de meio completo fresco e devolva ao poço da amostra para o ensaio de viabilidade.
    2. Remova os detritos celulares dos sobrenadantes coletados por centrifugação a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
    3. Transfira o sobrenadante clarificado para um tubo novo e titule o vírus infeccioso em células permissivas que não expressem os microRNAs cognatos. 
       NOTA: Mantenha todas as amostras em gelo para evitar perda de infectividade.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Água livre de nucleases	Fisher Scientific	AM9938
Reagente de transfeção TransIT-2020	Mirus	MIR 5404
Reagente de transfeção TransIT-mRNA	Mirus	MIR 2225
Tubos com tampa rosqueável de 2 mL	Sarstedt	72.694.005
Miméticos de microRNA	Dharmacon	Varied
Ensaio de proliferação celular MTT	ATCC	30-1010K