Produção e Colheita de Células Epiteliais Terapêuticas Produtoras de Vírus

Resumo

Fonte: Heidbuechel, J. P., et al.. Paramixovírus para Imunomodulação Direcionada a Tumores: Desenho e Avaliação Ex Vivo. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra o processo de infecção de células epiteliais renais com vírus geneticamente modificados para sua produção e coleta, com o objetivo de estudar a replicação viral.

Protocolo

1. Determinação das Capacidades Replicativas e Citotóxicas de Vetores Virais que Codificam Imunomoduladores

Compare a cinética de replicação do vírus recombinante gerado e do vetor não modificado utilizando curvas de crescimento de um passo ou de múltiplos passos (GCs). Nas GCs de um passo, a progênie viral é avaliada após infecção simultânea de todas as células (teoricamente, 100% de infecção). As GCs de múltiplos passos iniciam com uma baixa porcentagem de células infectadas para acompanhar várias rodadas de replicação viral.

1. Para análise da cinética de replicação do vírus do sarampo, semeie 1 x 10⁵ células Vero em 1 mL de DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco) com 10% de FBS (soro bovino fetal) por poço em placas de 12 poços um dia antes da infecção. Plaque pelo menos dois poços para cada ponto temporal de interesse como réplicas técnicas.
2. Infete as células com o vírus em MOI baixa (multiplicidade de infecção) para curvas de múltiplos passos ou em MOI alta para curvas de um único passo (0,03 e 3 para MV ou vírus do sarampo, respectivamente) na replicação em células Vero. Substitua o meio por 300 µL de meio sem soro contendo a quantidade respectiva de vírus e incube a 37 °C e 5% de CO₂ por pelo menos 2 h. Remova o inóculo, adicione 1 mL de DMEM com 10% de FBS e continue a incubação.
3. Em pontos temporais relevantes, como 12, 24, 36, 48, 72 e 96 h após a infecção, recolha a progênie viral raspando diretamente as células no meio. Transfira o conteúdo de cada poço para um tubo individual, congele rapidamente em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C até a titulação.
   NOTA: As amostras replicadas podem ser agrupadas nesta etapa para análise dos títulos médios.
4. Recolha amostras de todos os pontos temporais. Descongele simultaneamente a 37 °C para avaliação da progênie viral. Agite em vórtex e pelletize os detritos celulares por centrifugação durante 5 min a 2.500 x g e 4 °C.
5. Calcule os títulos médios de cada construto e ponto temporal conforme descrito acima. Represente graficamente os títulos ao longo do tempo. Compare as curvas de crescimento de vetores com e sem transgenes inseridos, com diferentes transgenes ou com transgenes inseridos em posições distintas (ver Figura 1).

Resultados

Figura 1: Cinética de replicação e atividade lítica de vírus do sarampo recombinantes. (A) Curvas de crescimento em um único passo foram geradas após infecção de células Vero com o vírus do sarampo oncolítico não modificado (MV) ou com o vírus do sarampo que codifica um engajador biespecífico de células T (MV-H-mCD3xhCD20) em uma MOI de 1. Os títulos da prole viral foram avaliados nos pontos de tempo designados após a infecção, indicando cinéticas de replicação viral semelhantes. São apresentadas as médias e desvios padrão de oito amostras (quatro réplicas técnicas de cada uma das duas réplicas biológicas por ponto de tempo). (B) A viabilidade celular foi avaliada em células de carcinoma colorretal murino MC38 que expressam estavelmente o antígeno carcinoembrionário humano e o receptor do MV CD46 (MC38-CEA-CD46) após inoculação apenas com meio (controle negativo) ou com os vírus indicados em uma MOI de 1. O ensaio de viabilidade celular XTT foi realizado nos pontos de tempo indicados. Observou-se redução na viabilidade celular em pontos de tempo mais precoces para o vetor não modificado. Valores superiores a 100%, como calculados para o MV-H-mCD3xhCD20 no ponto de tempo de 12 h, são frequentemente observados logo após a infecção, o que pode ser devido ao estresse celular ou a fatores derivados de células presentes na suspensão viral. São apresentados os valores médios mais desvios padrão de três réplicas técnicas para cada ponto de tempo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio Essencial Modificado por Dulbecco (DMEM)	Invitrogen, Darmstadt, Alemanha	31966-021	Utilizado para semeadura e infecção de células Vero
Soro Bovino Fetal (FBS)	Biosera, Boussens, França	FB-1280/500	Para suplementação do DMEM
Células Vero	ATCC, Manassas, VA, EUA	CCL81	Células hospedeiras para propagação e ensaio do vírus do sarampo
Placas de 12 poços	Neolab, Heidelberg, Alemanha	353043	Para semeadura de células Vero (1 × 10⁵ por poço)
Opti-MEM (meio sem soro)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Alemanha	31985070	Para etapa de infecção viral (incubação sem soro)
Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Alemanha	14190-094	Para lavagem e preparação de meio
Lifter celular	Corning, Reynosa, México	3008	Utilizado para raspagem das células infectadas na coleta
Tubos de 50 mL	nerbe plus, Winsen/Luhe, Alemanha	02-572-3001	Para coleta de amostras e centrifugação
Nitrogênio líquido	—	—	Para congelamento rápido das amostras virais coletadas
Centrífuga (capaz de 2.500 × g)	—	—	Para sedimentação de detritos celulares
Kit de Viabilidade Celular XTT (Kit Colorimétrico de Viabilidade Celular III)	PromoKine, Heidelberg, Alemanha	PK-CA20-300-1000	Inclui reagente XTT; para medição de citotoxicidade
Placas de 96 poços, fundo plano	Neolab, Heidelberg, Alemanha	353072	Para medição de absorbância a 450 nm
Espectrofotômetro / Leitor de microplacas	—	—	Para medição da absorbância óptica a 450 nm (referência 630 nm)
Incubadora de dióxido de carbono	—	—	37 °C, 5% CO₂ para todas as incubações celulares