Avalie a funcionalidade imunológica de imunomoduladores isolados. A seguir, descreve-se em detalhes como avaliar a citotoxicidade mediada por células induzida por engajadores bispecíficos de células T (BTE, na sigla em inglês) por meio do ensaio de liberação de lactato desidrogenase (LDH). Defina as condições a serem testadas durante o experimento (veja a Figura 1 como exemplo). Pode-se variar os pontos temporais (horas a dias), as concentrações do imunomodulador (de pg/mL a µg/mL) e as razões efetoras por células-alvo (E:T) (entre 1:50 e 50:1, por exemplo). Sempre prepare as amostras em triplicata. Inclua amostras sem proteína BTE e sem células efetoras, controles para liberação espontânea de LDH dos tipos individuais de células (Tsp e Esp), um controle de lise máxima da célula-alvo (Tmax) com detergente adicionado antes da leitura, um controle com meio apenas e um controle de volume para Tmax. OBSERVAÇÃO: os números necessários de células-alvo e os tempos de incubação podem variar. Realize corridas iniciais de teste sem células efetoras e imunomoduladores para identificar os parâmetros ideais. Inclua amostras de Tsp e Tmax e os controles correspondentes para avaliar diferentes números de células e pontos temporais. Isole células efetoras imunes (por exemplo, por meio de centrifugação em gradiente de densidade de sangue humano para obter células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) ou seleção negativa de linfócitos T murinos a partir de esplenócitos de camundongo). Plaque as células-alvo (por exemplo, 5 x 10³ por poço) em uma placa de 96 poços com fundo em U. Adicione a proteína isolada nas concentrações desejadas aos respectivos poços. Adicione as células efetoras imunes nas razões desejadas. Adicione meio até um volume total de 100 µL por poço. Incube pelo tempo determinado, tipicamente entre 4 e 48 h (24 h para PBMCs não estimulados e 48 h para linfócitos T murinos recém-isolados; tempos de incubação mais curtos podem ser aplicados para células imunes previamente estimuladas), a 37 °C e 5% CO₂. Quarenta e cinco minutos antes da coleta das amostras, adicione 10 µL de solução de lise 10x aos poços contendo as amostras Tmax e os controles correspondentes de meio. Continue a incubação. Centrifugue as células a 250 x g durante 4 min. Transfira 50 µL de cada sobrenadante para uma placa de 96 poços com fundo plano. Não transfira as células para evitar a LDH ligada às células. Prepare a solução de substrato conforme as instruções do fabricante. Adicione 50 µL a cada poço e incube à temperatura ambiente [RT] no escuro por 30 min ou até que as amostras Tmax fiquem vermelho-escuras. Adicione 50 µL de solução de parada a cada poço. Remova as bolhas de ar por centrifugação durante 1 min a 4.000 x g e manualmente com uma agulha oca. Meça a absorbância óptica a 490 nm. Calcule os valores de lise específica percentual para cada amostra. Calcule as médias dos triplicatos dos controles de meio com e sem solução de lise. Subtraia os valores obtidos das amostras experimentais e dos controles Tmax e de liberação espontânea, respectivamente. Utilize esses valores corrigidos para o fundo em cálculos posteriores. Calcule as médias dos controles Tmax, Tsp e Esp corrigidos para o fundo. Utilizando esses valores médios, a seguinte equação fornece a porcentagem de lise específica para cada amostra: Plote os valores de lise específica percentual versus concentração da proteína ou razão E:T e compare com as amostras de controle não direcionadas. Heidbuechel, J. P., et al.. Paramixovírus para Imunomodulação Direcionada a Tumores: Desenho e Avaliação Ex Vivo. J. Vis. Exp. (2019).
Este vídeo demonstra um ensaio celular para avaliar a atividade imunomoduladora específica de um engajador bispecífico de células T (BTE) codificado por vírus. O BTE liga células tumorais que expressam um receptor-alvo a células T, desencadeando a lise tumoral e a liberação de enzimas. Uma leitura colorimétrica, baseada na conversão do substrato, indica a ativação das células T. Maior intensidade de cor na amostra-teste confirma o engajamento imunológico mediado pelo BTE e específico ao receptor.
