Recuperação de vírions infecciosos de células transfectadas com RNA sintético derivado de cromossomo artificial bacteriano

Resumo

Fonte: Yun, S. et al. Cromossomos Artificiais Bacterianos: Uma Ferramenta de Genômica Funcional para o Estudo de Vírus de RNA de Fita Positiva. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra a recuperação do vírus da encefalite japonesa infeccioso a partir de RNA sintético transcrito de um clone de cromossomo artificial bacteriano. Mostra como as células são eletroporadas com o RNA sintético, permitindo que o genoma viral oriente a produção de novos viriões. As placas resultantes formadas em monocamadas de células infectadas confirmam o resgate bem-sucedido do vírus infeccioso.

Protocolo

1. Determinar a Infectividade do RNA e o Rendimento Viral

1. Cultive células de rim de hamster bebê-21 (BHK-21) em placas de cultura de 150 mm numa densidade de 3 × 10⁶ células/placa por 24 h a 37 °C com 5% de CO₂.
   NOTA: Mantenha as células BHK-21 em meio mínimo essencial alfa suplementado com 10% de soro bovino fetal, 2 mM de glutamina, vitaminas e penicilina/estreptomicina.
2. Lave a monocamada celular com 10 ml da Solução A fria (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 8,1 mM de Na₂HPO₄ e 1,5 mM de KH₂PO₄). Desprenda as células das placas com 4 ml de tripsina-ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) (0,25%) e recolha-as por centrifugação a 270 × g em uma centrífuga de bancada durante 2 min.
3. Resuspenda o pellet celular com 50 ml da Solução A fria em um tubo cônico de 50 ml e centrifugue a suspensão celular a 270 × g durante 2 min. Repita este procedimento de lavagem três vezes; após a última lavagem, ressuspenda o pellet celular numa densidade de 2 × 10⁷ células/ml na Solução A.
4. Misture uma alíquota de 400 µl da suspensão celular com 2 µg de RNA sintético em uma cubeta de 2 mm de afastamento e eletropore imediatamente a mistura com um eletroporador sob condições ótimas de eletroporação: 980 V, duração do pulso de 99 µs e 5 pulsos (Figura 1C).
5. Deixe as células eletroporadas à temperatura ambiente (TA) por 10 min e transfira-as para um microtubo de 1,7 ml contendo 600 µl de meio de cultura completo.
6. Prepare uma diluição seriada de 10 vezes das células eletroporadas em 1 ml de meio de cultura completo e plaque uma alíquota de 100 µl de cada diluição sobre as monocamadas de células BHK-21 não eletroporadas (5 × 10⁵) em uma placa de 6 poços.
7. Após 4-6 h de incubação, recubra as células com 0,5% de agarose em meio mínimo essencial contendo 10% de soro bovino fetal. Incube as placas por 4 dias a 37 °C com 5% de CO₂.
8. Visualize os centros infecciosos (placas) por fixação com formaldeído a 7% e coloração com violeta cristal a 1% em etanol a 5% (Figura 2A).
   1. Opcional: Examine as células eletroporadas com RNA entre 18-20 h pós-transfecção quanto à expressão da proteína do vírus da encefalite japonesa (JEV) por ensaios de imunofluorescência (Figura 2B) e colete os sobrenadantes das células eletroporadas com RNA em 22 e 40 h pós-transfecção para titulação viral por ensaios de placa (Figura 2C).

Resultados

Figura 1. Visão geral da recuperação de vírus infecciosos a partir de um DNA complementar (cDNA) completo do JEV SA₁₄-14-2 montado em um cromossomo artificial bacteriano (BAC). (A) Linearização do molde de cDNA. O BAC completo do JEV é cortado com XbaI e tratado com nuclease de feijão-mungo (MBN). (B) Síntese dos transcritos de RNA. O cDNA linearizado é transcrito pela polimerase de RNA SP6 na presença do análogo de cap m⁷G(5')ppp(5')A. (C) Recuperação dos vírus sintéticos do JEV. Os RNAs transcritos in vitro são transfetados em células BHK-21 por eletroporação, gerando um título elevado de vírus sintético.

Figura 2. Infectividade específica dos RNAs sintéticos transcritos a partir de um BAC completo de JEV e recuperação do vírus sintético. Células BHK-21 são eletroporadas falsas (Mock) ou eletroporadas com os transcritos de RNA derivados de cada um dos dois clones independentes do BAC completo de JEV (Cl.1 e Cl.2). (A) Infectividade do RNA. As células são recobertas com agarose e coradas com violeta cristal quatro dias após a transfeção. A infectividade do RNA é determinada por ensaios de centros infecciosos para estimar a quantidade de RNA infeccioso eletroporado nas células (painel esquerdo). Além disso, são mostradas imagens representativas de centros infecciosos (painel direito). (B) Expressão proteica. As células são cultivadas em lâminas com câmara de 4 poços. A expressão de proteínas virais em células eletroporadas com RNA 20 horas após a transfeção (hpt) é analisada por ensaios de imunofluorescência utilizando um anticorpo primário coelho anti-proteína não estrutural 1 (NS1) e um anticorpo secundário de cabra anti-coelho imunoglobulina G (IgG) conjugado com Cy3 (vermelho). Os núcleos são contra-coloridos com 4',6-diamidino-2-fenilindol (azul). As imagens de imunofluorescência são sobrepostas às suas imagens correspondentes de contraste de interferência diferencial. (C) Rendimento viral. As células são cultivadas em placas de cultura de 150 mm. A produção de viriões infecciosos acumulados nos sobrenadantes de cultura de células eletroporadas com RNA em 22 e 40 horas após a transfeção (hpt) é examinada por ensaios de placas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio Mínimo Essencial Alfa	Life Technologies (Gibco)	12561-049
Agarose	Lonza	50004
Tubo Cônico (50 mL)	VWR	21008-242
Violeta de Genciana	Sigma-Aldrich	C0775
Placa de Cultivo (150 mm)	TPP	93150
Cubeta (Fenda de 2 mm)	Harvard Apparatus	450125
Soro Bovino Fetal	Life Technologies (Gibco)	16000-044
Formaldeído	Sigma-Aldrich	F1635	Tóxico e carcinogênico
Glutamina	Life Technologies (Gibco)	25030-081
Meio Mínimo Essencial	Life Technologies (Gibco)	61100-061
Penicilina/Estreptomicina	Life Technologies (Gibco)	15070-063
Cloreto de Potássio	Sigma-Aldrich	P3911
Fosfato Monobásico de Potássio	Sigma-Aldrich	P9791
Placa de Seis Poços	TPP	92006
Cloreto de Sódio	Sigma-Aldrich	S3014
Fosfato Dibásico de Sódio	Sigma-Aldrich	S3264
Tripsina-EDTA (0,25%)	Life Technologies (Gibco)	25200-056
Vitaminas	Sigma-Aldrich	M6895
Incubadora de CO₂	Thermo Scientific	Heracell 150i
Centrífuga de Bancada	Thermo Scientific	ST16R
Electroporador	Harvard Apparatus	ECM 830