Aplicação e medições diretas de forças sobre os neurônios na faixa Microdyne 2000-1000 são obtidos com alta precisão usando agulhas de vidro calibrado. Esta metodologia pode ser usada para controlar e medir vários aspectos do desenvolvimento axonal, incluindo a iniciação axonal, a tensão axonal, a velocidade de alongamento axonal, e vetores de força.
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Artigo de método
A manipulação mecânica de Neurônios para controlar o desenvolvimento Axonal
Neste artigo
Resumo
Resumo
Manipulações de células e extensão de axônios neuronal pode ser realizado com vidro calibrado micro-fibras capazes de medir e aplicação de forças na faixa de 1,2 1-10 μdyne. Medidas de força são obtidos através da observação da Hookean flexão das agulhas de vidro, que são calibrados por um método direto e empírica 3. Requisitos de equipamentos e procedimentos para a fabricação, calibração, tratamento e usando as agulhas sobre as células estão completamente descritos. A força de regimes tipos de células usadas anteriormente e diferente para que estas técnicas foram aplicadas demonstrar a flexibilidade da metodologia e são dados como exemplos para futuras investigações 4-6. As vantagens técnicas são as "visualização" contínua das forças produzidas pelas manipulações ea capacidade de intervir diretamente em uma variedade de eventos celulares. Estes incluem a estimulação direta e regulação do crescimento axonal e retração 7, assim como desapego e medições mecânicas em qualquer tipo de células cultivadas 8.
Protocolo
1. Fazer agulhas de vidro.
- Um extrator de micro-agulha ajustável é usado para fabricar agulhas com ponta cônica de cerca de 4 mm de comprimento e que estão fechados vigas sólidas. Em oposição a uma ponta longo e flexível, esta curta 4 mm de comprimento limites vibrações da ponta da agulha durante as experiências. Na região proximal da fibra de 4 mm, a agulha se reduz rapidamente a partir do diâmetro do tubo de vidro de 15 mm em 1 mm, enquanto que o distal mais de 1 mm da fibra é de 2,5 m de diâmetro. Usamos R-6 tubo capilar de vidro, 0,9 mm OD, ID 0,6 milímetros de comprimento 8 "e um puxador de BB-CH. Se o investigador está interessado em faixas de mediç....
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Discussão
Técnicas para aplicar e medir forças celulares têm uma longa história 9. Nosso método foi originalmente motivado pelo trabalho de Dennis Bray, que usou agulhas de vidro semelhante ao nosso para "rebocar" os neurônios em uma taxa constante através de um dispositivo motorizado hidráulico 10. Existem muitos meios alternativos de aplicação de forças para as células que incluem: motores de passo 11, 12 esferas magnéticas, vigas microfabricated 13 e fluxos de fluido 1.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos as importantes contribuições do Dr. Robert E. Buxbaum no desenvolvimento desta metodologia.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo capilar R-6 | Drummond Scientific | 9-000-3111 | Tubo de vidro R-6, OD 0,9 mm, ID 0,6 mm, 8" |
| Puxador BB-CH | Mecanex S.A., Genebra, Suíça | BB-CH puller | Utilize o Modo 4 Alt com CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000 |
| Fio de Cromel 0,001" | Omega Engineering, Inc. | SPCH-001-50 | Fio termopar sem revestimento, carretel de 50 pés, agora chamado Chromega |
| Fio de Constantan 0,003" | Omega Engineering, Inc. | SPCI-003-50 | Fio termopar sem revestimento, carretel de 50 pés |
| Pinça fina | Fine Science Tools | 91150-20 | Dumont Inox nº 5 |
| Suporte universal para microscópio com braço articulado | Nikon Instruments | 76135 ou 90430 | A maioria das marcas ou tipos de suporte com braço articulado funcionará para este uso |
| Micromanipulador mecânico | Narishige International | M-152 | Micromanipulador mecânico de três eixos com acionamento direto |
| Micromanipulador hidráulico | Narishige International | MO-203 | Agora disponível como MMO-203, tipo com três eixos móveis |
| Porta-agulha | Leica Microsystems | 11520145 | Jogo com 3 unidades |
| Suporte simples para instrumento | Leica Microsystems | 11520142 | |
| Suporte duplo para instrumento | Leica Microsystems | 11520143 | |
| Micromanipulador mecânico | Leica Microsystems | 39430001 | Montagem em haste, 1 suporte para sonda, modelo RH 430001 |
| Micromanipulador mecânico com joystick | Leica Microsystems | 11520137 | |
| Leica DM IRB | Leica Microsystems | Microscópio invertido | |
| Mesa de isolamento Vibraplane | Kinetic Systems | Série 1200 | O nosso é o modelo 1201-02-12 |
| Ringcubator | Construído artesanalmente (ver referência 19) | Referência 19, requer controlador atualizado listado abaixo | |
| Controlador de temperatura programável | Instrumart.com | Fuji Electric PXR3 | Substitui o controlador de temperatura descontinuado PXV3 |
| Nikon Diaphot TMD | Nikon Instruments | Microscópio invertido, aproximadamente de 1980 | |
| Nikon SMZ-10, binocular para dissecação | Nikon Instruments | Outros microscópios para dissecação funcionarão |
Referências
- Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation. J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).
- Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons. <....
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Reimpressões e permissões
