Estudar a Integração da Adult-nascido Neurônios

Resumo

Uma maneira de estudar a integração de recém-nascidos células granulares denteado em animais adultos é descrito. Esta técnica utiliza um retrovírus engenharia para rotular neurônios recém-nascidos, seguido de gravações eletrofisiológicas para determinar a integração funcional vivo.

Resumo

Neurogênese ocorre em cérebros de mamíferos adultos na zona sub-ventricular (SVZ) do ventrículo lateral e na zona sub-granular (SGZ) do giro denteado do hipocampo durante toda a vida. Relatórios anteriores têm mostrado que a neurogênese do hipocampo adulto está associada a diversas doenças cerebrais, incluindo a epilepsia, esquizofrenia, depressão e ansiedade (1). Decifrando o processo de integração neurônio normal e aberrante adulto-nascido pode lançar luz sobre a etiologia destas doenças e informar o desenvolvimento de novas terapias.

SGZ neurogênese adulta espelhos embrionário e pós-natal o desenvolvimento neuronal, incluindo as etapas de especificação de destino, migração, integração sináptica, e maturação. No entanto, a integração ocorre ao longo de um prolongado, período de 6 semanas. Entrada sináptica inicial para adultos-nascido SGZ células granulares denteado (PED) é GABAérgica, seguido da entrada glutamatérgica menos 14 dias (2). Os fatores específicos que regulam a formação de circuito de adulto-nascido neurônios no giro dentado são actualmente desconhecidas.

Nosso laboratório utiliza uma réplica deficiente do vetor retroviral com base no vírus da leucemia murina Moloney para entregar proteínas fluorescentes e hipótese de genes reguladores a essas células a proliferar. Esta técnica fornece viral elevada especificidade e resolução para a análise da data de nascimento de células, a linhagem, morfologia e sinaptogênese.

A experiência típica muitas vezes emprega dois ou três vírus contendo rótulo único, transgene, e elementos de promotor para uma única célula de análise de um processo de desenvolvimento desejado in vivo. O protocolo a seguir descreve um método para analisar a integração funcional dos neurônios recém-nascido através de um único verde (GFP) ou vermelho (dTomato) retrovírus proteína fluorescente e patch-clamp eletrofisiologia.

Protocolo

1. Injeção de vírus

Alto título de retrovírus engenharia (1 × 10 ⁹ unidade / ml) é produzida por co-transfecção de vetores retrovirais em células e VSVG HEK293T, seguido por ultracentrifugação do sobrenadante viral. Para as fontes e métodos de produção, ver a demonstração JOVE excelente (3).

Nota: adultos jovens (4-6 semanas de idade) do sexo feminino camundongos C57BL / 6 (Charles River) estão alojados em condições normais. Todos os procedimentos seguem o Manual do Conselho Nacional de Pesquisa para o cuidado e uso de animais de laboratório sob um protocolo aprovado pelo Stony Brook University IACUC.

1. 2ul degelo dos retrovírus congeladas por animal no gelo.
2. Anestesiar (100 mg + 10 quetamina xilazina mcg por grama de peso corporal) e montar o animal em uma estrutura estereotáxica (Steolting). Remover o cabelo na cabeça e limpe a pele com álcool 70%.
3. Expor o crânio e faça quatro furos rasos usando uma broca de dentista (0,6 mm broca) na seguintes coordenadas:
   • anterioposterior = mm -2 de bregma; lateral = ± 1,6 mm; ventral = 2,5 mm; anterioposterior = mm -3 de bregma; lateral = ± 2,6 mm; ventral = 3,2 mm.
   • anterioposterior = mm -2 de bregma; lateral = ± 1,6 mm; ventral = 2,5 mm; anterioposterior = mm -3 de bregma; lateral = ± 2,6 mm; ventral = 3,2 mm.
4. Montar um Hamilton 1μl, flat ponta da seringa e injetar 0,5 mL por local de retrovírus em uma taxa de 0,25 mL / min no giro denteado. (Veja as coordenadas acima de profundidade ventral.) Pause 2 minutos após cada injecção antes de retirar a seringa lentamente para evitar o refluxo do fluido. Entre as injeções, brevemente lavar a superfície externa da ponta da seringa com PBS estéril e um aplicador para remover vestígios de sangue.
5. Fechar a ferida com material de sutura cirúrgica estéril (tipo P-1; Tamanho 6-0) eo retorno do animal às condições de alojamento padrão até os estágios de tempo desejado após a injeção.

2. Preparação fatia

Para obter alta qualidade fatias aguda de camundongos adultos, usamos uma solução de corte modificada para a preparação fatia (veja abaixo).

1. Pré-chill solução de corte de 0-4 ° C no gelo e bolhas com 95% de O ₂ -5% CO ₂ por pelo menos 30 minutos.
2. Anestesiar e transcardially perfundir um animal com gelado solução saturada de oxigênio de corte.
3. Remover rapidamente o cérebro em uma placa de Petri com papel-filtro pré-umedecido com frio, solução oxigenada de corte. Cortar o cerebelo e uma fatia superfície de montagem, pelo menos, um milímetro anterior para as coordenadas de injeção (visível). Cola do cérebro em um estágio vibrotome e montá-la na câmara de corte cheio de frio e oxigenado solução de corte.
4. Prepare as fatias coronal ou horizontal (300-350μm) e transferi-las com uma pipeta de grande calibre a uma câmara de incubação contendo temperatura ambiente ACSF aeradas com 95% O ₂ / 5% CO _2.
5. Incubar as fatias, borbulhando de forma contínua, a 32 ° C por 30-60 minutos. Retorno da câmara à temperatura ambiente para a duração da gravação.

3. Experimentos eletrofisiológicas

1. Fatias são transferidos para a câmara de gravação que é continuamente perfundidos com oxigênio saturado ACSF em 32 ° C - 34 ° C.
2. Um eletrodo de estimulação bipolar de tungstênio é colocado na camada molecular do giro denteado utilizando uma objetiva de microscópio de baixa ampliação (10X).
3. PED recém-nascido na zona sub-granular / camada de células granulares são identificados pela expressão de GFP ou dTomato. De célula inteira de gravação patchclamp é realizada em neurônios recém-nascidos sob alta ampliação (40X).
4. Propriedades de queima das células gravadas são obtidas por injeção de uma série de correntes sob clamp de corrente de modo.
5. Estímulos elétricos são entregues pelo eletrodo de estimulação através de um isolador de estimulação controlado pelo software de gravação, e evocou as correntes pós-sinápticos no PED recém-nascidos são registrados.

4. Análise de Dados

Amplitudes de respostas evocadas pós-sinápticos são analisados ​​em diferentes estágios de desenvolvimento do adulto-nascido neurônios.

5. Resultados representante

Usando o protocolo acima, GFP expressão em recém-nascidos neurônios do giro denteado semelhante à Figura 1 é comum. Note-se que os neurônios recém-nascidos são facilmente visualizadas e ambos dendritos e axônios são fortemente marcadas. Expressão em thin axônios DGC e pequenas espinhas depende da qualidade e de título do vírus, o promotor utilizado ea duração da expressão em vivo. Em nossas mãos, as células recém-nascido e sub-celular organelas são normalmente visíveis dentro de poucos dias após a injeção, e expressão da coluna pode ser rastreada desde os primeiros estágios de desenvolvimento. Wburaco células gravações dos neurônios recém-nascidos em estágios diferentes de tempo permitem o estudo das propriedades únicas células recém-nascido, por exemplo, potenciais de ação (Figura 2a), bem como o processo de integração sináptica em circuitos neurais existentes durante a maturação (Figura 2b).

Figura 1 imagem 2-fótons confocal de neurônios recém-nascido em uma seção de giro horizontal denteado de um rato adulto. Células verdes são 21dpi (dias pós-injeção) expressando GFP-PED recém-nascido rotulados com PUX-GFP retrovírus.

Figura 2 a, b) Ação potencial de disparo propriedades de um recém-nascido DGC aos 21 dpi.) Representante evocado correntes excitatórias pós-sináptico (EPSCs) gravado em um recém-nascido DGC aos 21 dpi.

Discussão

Neurogênese contínua no hipocampo do cérebro de mamíferos adultos oferece um sistema único modelo experimental para estudar o desenvolvimento e integração neuronal no cérebro maduro. O protocolo aqui apresentado combina rotulagem retroviral e métodos eletrofisiológicos para estudar a integração de recém-nascidos neurônios granulares denteado no cérebro de ratos adultos.

Para garantir que seus experimentos forem bem sucedidos, recomendamos o seguinte durante etapas críticas do processo:

Para evitar a infecção e inflamação indesejável, todas as ferramentas devem ser esterilizados (em autoclave, qualquer tipo de esterilizador, ou etanol 70%) antes da cirurgia. Use PBS estéril para lavar a ponta da agulha da seringa antes da injeção.

Para injecção de vírus, os animais devem ser bem montado no dispositivo estereotáxico e fontes de movimentos desnecessários devem ser minimizados durante a injeção. Certifique-se a cabeça está bem fixo e firme, e ajustar a posição do nariz do mouse para nível bregma e lambda antes de coordenadas de injeção de cálculo. Extrato de vírus para dentro da seringa rapidamente para minimizar a exposição a temperaturas quarto - retrovírus são particularmente sensíveis à temperatura. Injetar o vírus lentamente na dose recomendada para minimizar os danos de pressão. Usando o recomendado seringa de ponta chata (vs. ponta chanfrada comum) irá garantir uma uniformemente distribuído área infecção giro denteado.

Antes de preparar fatias, o corte de solução e incubar ACSF devem ser aeradas com 95% O CO ₂ -5 _2% para pelo menos 30 minutos para permitir que o oxigênio para saturar as soluções. Os animais devem ser perfundidos com rapidez e tecidos mantidos em frio, solução saturada de oxigênio para a melhor qualidade fatia.

Para a gravação, aumente a intensidade do estímulo progressivamente até que haja uma resposta pós-sináptica. Mudar o local do eletrodo de estimulação dentro da camada molecular do giro denteado, se necessário.

Em resumo, a abordagem recomendada oferece uma maneira de explorar as propriedades distintas e possíveis papéis funcionais do adulto-nascido neurônios durante a fase inicial de integração em circuitos, ativo maduro.

Materiais

• Corte de solução (em mM): 110 cloreto de colina, 2,5 KCl, 1,3 KH ₂ PO _4, 25,0 NaHCO _3, 0,5 CaCl _2, 7 MgCl _2, 10 dextrose, 1,3 de ascorbato de sódio, 0,6 piruvato de sódio, ácido 5,0 cinurênico.
• Fluido cérebro-espinhal artificial (ACSF, em mM): NaCl 125,0, 25,0 NaHCO _3, 2,5 KCl, 2 CaCl _2, 1,3 KH ₂ PO _4, 1,3 MgCl _2, 1,3 ascorbato de sódio, 0,6 piruvato de sódio, 10 dextrose.
• Solução interna para toda célula patchclamp (em mM): 120 gluconato de potássio, KCl 15, 4 MgCl _2, 0,1 EGTA HEPES, 10.0, 4 MgATP, 0,3 Na ₃ GTP, 7 de fosfato (pH 7,4, 300 mOsm).