Preparação colagenase
- Pesar a colagenase em um buffer de 50 ml de isolamento ml e juntar para fazer a concentração final, conforme indicado na tabela abaixo. Dissolver a colagenase em vortex.
(12 + 2 ratos ratos extra = 14 ratos x 5 ml / mouse = 70 ml de solução de colagenase total)
(70 ml x 0,5 mg / ml ou 0,3 mg / ml = 35 mg ou 21 mg de colagenase total P)Tensão Idade Colagenase P (mg / ml) Tempo (min) C3H, Balb / C, B6 > 12 semanas 0,8 17 C3H, Balb / C, B6 <= 12 semanas 0,5 13 NOD, NOR, NÃO > 12 semanas 0,8 17 NOD, NOR, NÃO <= 12 semanas 0,5 17 - Dispense 2 ml de solução de colagenase em cada frasco de vidro e colocar no gelo. Carregar cada seringa de 5 ml com 3 ml de colagenase agulha 30g adicionar e coloque em gelo (preparar na capa).
Distensão
- Pouco antes de dissecção, o sacrifício de animais por deslocamento cervical. Pulverizar o corpo inteiro com 70% de álcool etílico, tornando-o completamente molhado. Faça uma V-Insision começando na área genital. Girar o mouse para a cauda está enfrentando longe de você.
- Retire do intestino para o lado esquerdo do mouse em aberto. Isto irá expor o pâncreas e do duto biliar comum.
- Coloque uma pinça hemostática de cada lado do intestino delgado, onde o ducto biliar drenos, deixando uma pequena bolsa para solução de colagenase a entrar no intestino.
- Inflar o pâncreas através do ducto biliar com uma agulha 30g e seringa de 5 ml contendo 3 ml de solução de colagenase frio, a partir da vesícula biliar.
- Remover o pâncreas do corpo e colocá-lo em um frasco siliconizado contendo 2 ml de solução de colagenase. Esta etapa deve ser feito rapidamente e tão limpa quanto possível, minimizando coleção de gordura e tecido conjuntivo.
- Coloque o frasco sobre o gelo e 3 repita o passo com o mouse que vem.
Digestão
- Seal cada frasco e coloque-o a 37 ° C em banho-maria. Incubar durante 13-17 minutos (o tempo varia com a tensão ea idade do animal).
- Após o tempo decorrido, agite o frasco vigorosamente. O pâncreas devem desmoronar.
- Despeje cada digestão através de um filtro estéril, pia grande em um copo ml estéril 1000 e com força pipeta fora da tela com tampão de lavagem. Dispense o digere em tubos de 50 ml conicals (3 ml tubo pancreata/50: se n = 12, use o suficiente lavar buffer para fazer a final do volume 200 ml e fornecê-las para tubos 4x50 ml). A diluição deve ser feito rapidamente e com gelo para evitar a digestão das ilhotas indesejados.
- Spin down: Iniciar a centrífuga. Quando se chega a 1300 rpm, desligá-lo.
- Aspirar o sobrenadante, deixando ~ 5 mL. Tenha muito cuidado para não aspirar o sedimento.
- Ressuspender pellet tocando vigorosamente com a mão, em seguida, adicione 50 ml de tampão de lavagem.
- Spin down: Iniciar a centrífuga. Quando se chega a 1300 rpm, desligá-lo.
- Ressuspender o sedimento e lavar com 5 ml de tampão de lavagem.
- Transferir os 5 ml a 15 ml cônico e spin down, como acima.
- Aspirar o sobrenadante forma mais completa possível. (Buffer restante pode causar a mudança de densidade do Ficoll).
Ficoll
Executar rapidamente. Exposição a longo prazo Ficoll é tóxico para ilhotas.
- Certifique-se de pellet é completamente quebrado antes de adicionar Ficoll (tecido intacto é difícil de ressuspender em Ficoll).
- Ressuspender o sedimento em 7 ml de Ficoll, a densidade de 1,108, em vortex vigorosamente.
- Camada em cima de cada densidade de Ficoll 2ml de cada uma das densidades restantes na seguinte ordem: 1,096, 1,069, 1,037, em seguida.
- Giro por 15 minutos a 1800 rpm a 4 graus, com quebra OFF!
- Escolha ilhotas da segunda camada utilizando spoid (p estérilconta-gotas lastic). Transferência de todas as coleções para um contendo 50 ml ~ cônico 25 mL de tampão frio.
- Lavagem, como acima, 3 vezes com tampão de lavagem (repetindo a etapa 12-15).
- Ilhotas ressuspender em 20 ml RPMI-1640 (contendo 10% SFB e penicilina e estreptomicina, HEPES, MEM-NEAA) e misture delicadamente. Retirar 100 ul de amostra para contagem.
- Transferir 100 ul a 35 placa Grid-mm contendo 1 ml de mídia e um ditizona ml.
- Incubar ilhotas restante em RPMI 1640, em um 37 ° C, 7% incubadora de CO 2, em 160 mm, com placas de um total de 30 ml de media / prato.
