Modificado ES / OP9 Co-Protocol Cultura Fornece Caracterização melhorada de Progênie Hematopoiéticas

Resumo

mStrawberry OP9 células permitir uma avaliação completa de todos os descendentes ES-derivados de co-cultura.

Resumo

A diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias para um destino de células hematopoiéticas é útil quando se estuda populações de células que são de difícil acesso e in vivo para caracterizar os primeiros genes envolvidos na hematopoiese, sem ter que lidar com letalidades embrionárias. O ES/OP9 sistema de co-cultura foi originalmente projetada para produzir progênie hematopoiéticas, sem o excesso de produção de macrófagos, como a linha de células do estroma OP9 é derivada da calvária de ratos mutantes osteopetrose que a falta funcional M-CSF. A in vitro ES/OP9 sistema de co-cultura pode ser usado, a fim de recapitular desenvolvimento hematopoiético cedo. Quando cultivadas em OP9 células do estroma, células-tronco embrionárias se diferenciam em Flk-1 + hemangioblastos, progenitores hematopoiéticos e, finalmente, maduro, linhagens terminalmente diferenciadas. O padrão ES/OP9 protocolo de co-cultura implica a colocação de células-tronco embrionárias em uma camada confluente de células OP9, bem como, periódicos passos repique, a fim de remover o velho, contaminando OP9 células. Além disso, os protocolos atuais envolvem avaliar apenas as células hematopoiéticas, encontradas na suspensão e não são otimizados para a avaliação da ES-derivados de progênie em cada dia de diferenciação. No entanto, com passos repique ea colheita de células em suspensão apenas um potencialmente perde uma grande parte ES derivadas progênie e desenvolvimento de células hematopoiéticas. Esta questão torna-se importante abordar quando se tenta caracterizar defeitos hematopoiéticas associadas com linhas ES nocaute. Aqui nós descrevemos uma versão modificada ES / mStrawberry OP9 co-cultura, que permite a eliminação de contaminantes OP9 células de ensaios a jusante. Este método permite a avaliação completa de todas as progênies derivadas ES em todos os dias de co-cultura, resultando em um padrão de diferenciação hematopoiética, que mais directamente corresponde ao padrão de diferenciação hematopoiética observado dentro do embrião.

Protocolo

1. Preparação de células-tronco embrionárias

1. Cultura de células ES de acordo com protocolo padrão para sua linha de celular particular. Certifique-se de preparar células ES suficiente para chapa para do mStrawberry OP9 células para o dia 0 (células-tronco embrionárias será banhado em 1x10 ^ 3 células por cm ² no Dia 0)

2. Preparação de células OP9

1. Antes de crescimento mStrawberry OP9 células, preparar o OP9 meios de crescimento
   OP-9 meio de cultura celular
   

   	Estoque	Conc final.	Volume (mL)
   AMEM			39,5
   FBS (OP-9 testado)	100%	20%	10
   L-glutamina	100X (200mm)	2mM	0,5
   			50mL

   
   Armazenar a 4 ° C e usar dentro de uma semana de preparação
2. A fim de manter mStrawberry OP9 células, meios de comunicação devem ser trocados a cada dois dias e células devem ser repicadas antes de atingir células confluência (subcultura em 70-90% confluência). mStrawberry OP9 culturas de células são cultivadas nunca além de 90% confluência como isso irá resultar em sua diferenciação em adipócitos. Veja a Figura 3.
   1. Subcultura células por células de lavar 2X com PBS (1x ou com PBS 1x + 0,1% com Tripsina-EDTA)
   2. Adicionar pré-aquecido 0,1% Tripsina-EDTA a 37 ° C por 5 minutos (ou até retirar células)
   3. Quando as células têm destacado, adicione OP-9 meio de crescimento. Transferência de células para um tubo de 50 ml cônico.
   4. Células pelota a 300 xg por 5 minutos em temperatura ambiente. Elimine o sobrenadante.
   5. Ressuspender as células em fresco mStrawberry OP9 meios de crescimento
   6. Células em placas a uma densidade mínima de 10 ⁴ células / cm ²
   7. Crescer mStrawberry OP9 células a confluência de partida três dias antes do dia necessários para o cultivo de células co-ES (dia 0, dia 5, ou dia8 / 9 do experimento)

3. ES / mStrawberry OP9 Co-cultura

1. Prepare media Co-cultura de diferenciação
   

   	Estoque	Final	Volume (mL)
   AMEM			39,5
   FBS	100%	20%	10
   L-glutamina	200mM	2mM	0,5
   			50mL

2. mStrawberry OP9 células (dia -3)
   1. SEMPRE Subculture OP9 células em -3 Dia, para que você tenha camadas confluentes de células mStrawberry OP9 para 0 Dia da co-cultura. Ver Figura 4b. Placa mStrawberry OP9 células em 1x10 ⁴ cm / ² para confluência no Dia 0. Certifique-se de subcultura células extra para o dia 5 e dia 09/08 para o prosseguimento da co-cultura.
3. ES / mStrawberry OP9 co-cultura-Set-Up (Dia 0)
   1. Lave as células ES 2x com PBS
   2. Trypsinize células-tronco embrionárias com pré-aquecido 0,25% de tripsina-EDTA, incubar por 5 min @ 37 ° C
   3. Adicionar mídia Co-cultura de diferenciação para as células
   4. Pellet células ES em 400xg, 5-7min, RT. Elimine o sobrenadante
   5. Ressuspender as células em meios de co-cultura de diferenciação
   6. Remova a mídia da mStrawberry OP9 células
   7. Adicionar mídia Co-cultura de diferenciação para frascos mStrawberry OP9
   8. Placa de 1x10 ³ células ES / cm ² no balão da mStrawberry OP9 células. Incubar as células a 37 ° C, 5% CO ₂ com a umidade.
4. mStrawberry OP9 células (dia 2)
   1. MStrawberry subcultura OP9 para que você tenha camadas confluentes de células mStrawberry OP9 para o dia 5 de co-cultura. Placa mStrawberry OP9 células em 1x10 ⁴ cm / ² para confluência no dia 5 (como no passo 3.2). Certifique-se de subcultura células extra para o dia 09/08, se necessário (como no passo 2.2).
5. ES / mStrawberry OP9 co-cultura (dia 3)
   1. Cuidadosamente remova o meio de co-cultura e substituir por meio de diferenciação fresco co-cultura

6. ES / mStrawberry OP9 co-cultura (dia 5)

   1. Lavar cuidadosamente co-culturas 2x com PBS
   2. Trypsinize células com pré-aquecido 0,25% Tripsina-EDTA
   3. Lave as células off frasco com media Co-cultura de diferenciação
   4. Células de pelotização em 400xg, 7min, RT. Elimine o sobrenadante
   5. Adicionar mídia Co-cultura de diferenciação para as células. Use uma agulha calibre 21 bluntended para ressuspender as células e para assegurar a suspensão única célula
   6. Contagem de células utilizando um hemocitômetro. Deve ter aumento de 100-150 vezes no número de células ES desde o dia 0.
   7. Re-semente centímetros 6.48x10 ^02/04 - 7.76x10 ⁴ / cm ² co-cultura de células em uma nova camada de confluentes, mStrawberry OP9 células
   8. Dia 5 ENSAIOS-Restante co-cultura de células pode ser utilizado para análise de citometria de fluxo, cytopreps (30K células), ensaios de chip, etc
7. ES / mStrawberry OP9 co-cultura (dia 09/08 e dia 12)
   1. Remova a mídia de diferenciação do frasco e salvar. Lavar com PBS 1x monocamada para remover as células hematopoiéticas em suspensão. Não jogue fora as células hematopoiéticas.
   2. Trypsinize células aderentes com pré-aquecido 0,25% Tripsina-EDTA
   3. Lave as células off frasco com media diferenciação ES e adicione a células hematopoiéticas, encontradas em suspensão =
   4. Células de pelotização em 400xg, 7min, RT. Elimine o sobrenadante
   5. Adicionar Co-cultura de mídia ou PBS diferenciação para as células. Use uma agulha calibre 21 bluntended para ressuspender as células e para garantir a única célula de células em suspensão Conde utilizando um hemocitômetro.
   6. Co-cultura pode ser continuado por 14 dias para avaliar mais maduro progenitores hematopoiéticos por re-semeadura co-cultura de células em uma nova camada de confluentes, mStrawberry OP9 células no dia 8 ou 9 e depois novamente no dia 12. Re-semente número de células otimizado com base na recuperação de células necessárias para o dia de ensaio.
8. Avaliação do ES derivadas progênie (dia 14/01). ES derivadas progênie pode ser avaliado em qualquer dia da co-cultura pelo fluxo de classificar para fora mStrawberry células negativas (ES derivadas progênie).
   1. Remova a mídia de diferenciação do frasco e salvar. Lavar com PBS 1x monocamada para remover as células hematopoiéticas em suspensão. Não jogue fora as células hematopoiéticas.
   2. Trypsinize células aderentes com pré-aquecido 0,25% Tripsina-EDTA
   3. Lave as células off frasco com media Co-cultura de diferenciação e adicionar às células hematopoiéticas, encontradas em suspensão
   4. Células de pelotização em 400xg, 7min, RT. Elimine o sobrenadante
   5. Ressuspender as células com 21-gauge agulha bluntended e contar
   6. Progênie ES-derivada (mStrawberry células negativas) podem ser classificados de fluxo positivo mStrawberry OP9 células. Progênie ES-derivados podem ser caracterizados por análise de citometria de fluxo, cytopreps, ensaios chip, etc

4. Resultados representativos:

Figura 1. ES / mStrawberry OP9 Sistema de Co-cultura. Nosso laboratório utiliza um in vitro de células ES sistema de co-cultura para o desenvolvimento do modelo hematopoiéticas. Neste sistema de co-cultura, as células ES diferenciar, em hemangioblastos no 5 º dia, quando colocado em uma camada confluente de células mStrawberry OP9. Como o produto co-cultura, precursores hematopoiéticos estão presentes no dia 8, enquanto terminalmente diferenciadas linhagens hematopoiéticas aparecem por dia 14. Setas indicam dia de diferenciação quando passaging de ES derivadas progênie em novas camadas confluentes de células em mStrawberry OP9 necessário.

Figura 2. Diferenciação de células ES adequada. Células-tronco embrionárias são semeados em uma camada confluente de mStrawberry OP9 no Dia 0. ES derivadas progênie começa a tornar-se visível no dia 3 de diferenciação, com ES derivadas progênie parecendo um aglomerado de células com uma borda definida ou começando a se formar um padrão whorl. Hemangioblastos, que é o precursor comum mesodérmica para as linhagens endoteliais e hematopoiéticas, deve aparecer como amontoados espirais de células no dia 5. Para co-cultura períodos superiores a cinco dias, a ES-progênie derivada deve aparecer como aglomerados de células hematopoiéticas. Dois a quatro grupos unicelulares, no dia 07/06, deve aparecer e crescer em clusters maiores célula Dia 09/08 de co-cultura. Progênie ES outros derivados também são encontrados fortemente ligada à camada de células aderentes do estroma.

Figura 3. Diferenciação celular sem sucesso ES. Os resultados deste co-cultura refletem diferenciação celular imprópria ES. Observe como a progênie ES derivados não aparecem em um padrão whorl no dia 5. A ausência de células em um padrão whorl indica a formação hemangioblast impróprio. Se hemangioblast não se desenvolvem adequadamente, e depois continuou co-cultura vai resultar na diferenciação de linhagem hematopoiéticas atrofiado. Co-culturas com formação hemangioblast indevido deve ser descartada.

Figura 4. mStrawberry OP9 culturas de células. (A) mStrawberry células são subcultivadas em OP970-90% confluência. (B) Para a diferenciação adequada, as células ES e ES-progênie derivadas são colocadas em uma camada muito confluentes de mStrawberry OP9 células.

Figura 5. Representante ES / mStrawberry OP9 perfil de fluxo co-cultura. Todos os descendentes ES-derivados são mStrawberry células negativas e podem ser classificadas a partir do fluxo de mStrawberry OP9 células. porta celular mStrawberry negativa foi determinada usando um ES/OP9 tradicionais co-cultura.

Discussão

Diferenciação adequada de células ES na camada confluente de mStrawberry OP9 células resulta na produção de Flk1 hemangioblastos + no dia 5 de co-cultura. Hemangioblastos deve aparecer como amontoados espirais de células, como observado na Figura 1. Para o restante da co-cultura, da progênie ES derivadas visível deve aparecer como aglomerados de células hematopoiéticas (Figura 1). No Day6 / 7 03:58 grupamentos celulares deve aparecer e crescer em clusters célula maior (tanto aderentes e em suspensão) no dia 09/08 de co-cultura. Progênie ES outros derivados também são encontrados fortemente ligada dentro da camada de células aderentes do estroma.

Embora não incluída no protocolo, é essencial para pré-testar o FBS utilizado no meio de crescimento ES, o mStrawberry OP9 meios de crescimento e da ES / mStrawberry OP9 media diferenciação. Devidamente testados soro deve garantir um crescimento adequado de mStrawberry OP9 células, bem como, a diferenciação adequada de células ES em co-cultura até o dia 5 de diferenciação. Como uma alternativa ou para além mStrawberry OP9 células, OP9 células podem ser irradiados, em 8000 rads, antes da semeadura na confluência (7.8x10 ⁴ células / cm ^2). Irradiação de células OP9 permite a eliminação dos repetidos passos repique, bem como, permite a eliminação quase completa do velho, contaminando OP9 células de ensaios a jusante.

OP9 células foram projetadas para expressar a proteína mStrawberry transduzindo OP9 células com 3ug/mL de um vector lentiviral mStrawberry expressar sob o controle de um promotor CMV (CMV pRRLsin-vector, vector UCLA core).

Padrão ES/OP9 co-cultura protocolos implica a colocação de células-tronco embrionárias em uma camada confluente OP9 células, bem como, um dia passo replating 5, a fim de reduzir a idade, contaminando OP9 células de passagem de célula. Além disso, somente as células hematopoiéticas, encontradas em suspensão são removidos para a avaliação da ES derivadas progênie. No entanto, com tanto passo um repique ea colheita de células em suspensão potencialmente apenas um perde um número substancial de desenvolvimento ES-derivado células hematopoiéticas. Esta questão torna-se importante abordar quando se tenta caracterizar defeitos hematopoiéticas associadas com linhas ES nocaute. A fim de contornar este problema nosso laboratório usado uma versão modificada co-cultura, através do uso de mStrawberry expressando OP9 células. Isso garante que todos os descendentes ES são transferidos para o co-cultura continuou no dia 5, e para a colheita de todas as progênies derivadas ES para ensaios de downstream. Esta alteração prevê uma ferramenta útil na avaliação e caracterização de progênie hematopoiéticas derivadas de humanos e linhas ES mouse.

Este ES-mStrawberry OP9 co-cultura recapitula o modelo de vários estágios primitivos e hematopoiese definitiva. Ao estudar as fases iniciais do desenvolvimento hematopoiético, muitas pessoas usam a BL-CFC (Blast-como células formadoras de colônia) de ensaio, que avaliam o desenvolvimento do hemangioblast da célula ES. Enquanto o ensaio BL-CFC é uma ferramenta útil na investigação de desenvolvimento hematopoiético cedo, o mStrawberry-ES sistemas de co-cultura apresenta utilitário aumentar à medida que permite a avaliação da hemangioblast, bem como, mais adulto linhagens hematopoiéticas.

Trabalho anterior usando OP9/ES tradicionais e protocolos de diferenciação EB mostrou que fatores adicionais, talvez necessárias, como a superexpressão de HoxB4, a fim de obter a longo prazo repovoar células-tronco hematopoiéticas in vitro. Trabalho adicional é necessário avaliar se mStrawberry negativo, classificado ES derivadas populações contêm verdadeiras células-tronco hematopoéticas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
AMEM	Invitrogen	12571-063
FBS	Omega Scientific	FB01	Pré-testados
L-glutamina	Cellgro	25-005-CI	200nM
Tripsina-EDTA	Stem Cell Technologies	07901

Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
AMEM	Invitrogen	12571-063
FBS	Hyclone	SH30070	Pré-testados
L-glutamina	Cellgro	25-005-CI	200mM
PBS (sem Ca 2 + e Mg 2 +)	Cellgro	21-031-CV
Tripsina-EDTA	Stem Cell Technologies	07901