Para avaliar a In vivo Efeitos de intervenções terapêuticas para doenças musculares, são necessários métodos para quantificar a geração de força e cansaço no músculo tratado. Detalhamos uma abordagem para avaliar mio-mecânicas no músculo de rato explantado hindlimb. Esta análise proporciona uma abordagem robusta para quantificação dos efeitos da modificação genética na função muscular, bem como a comparação de tratamentos em modelos do rato da doença muscular.
Artigo de método
Myo-mecânico Análise do músculo esquelético isolado
Neste artigo
Resumo
Resumo
Para avaliar os efeitos in vivo de intervenções terapêuticas para o tratamento da doença muscular 1,2,3, métodos quantitativos são necessários a medida da força e fadiga no músculo tratado. Descrevemos uma abordagem detalhada para avaliar mio-mecânicas em recém-explantado muscular hindlimb do mouse. Descrevemos a colheita atraumática do mouse músculo longus extensor dos dedos, a montagem do músculo em um músculo strip myograph (Modelo 820MS; Tecnologia Myo dinamarquês), ea medição da contração máxima e tensão tetânica, tempo de contração e relaxamento meia-hora, usando um quadrados de pulso estimulador (Modelo S48; Technologies Grass). Usando essas medidas, demonstramos o cálculo da contração muscular específica e tensão tetânica normalizada para a área muscular transversal, a contração-a-tetânica relação de tensão, a curva de relação força-freqüência ea curva de fadiga de baixa freqüência 4. Esta análise fornece um método para comparação quantitativa entre as intervenções terapêuticas em modelos do rato da doença muscular 1,2,3,5, bem como comparação dos efeitos de modificação genética em função muscular 6,7,8,9.
Protocolo
O protocolo é realizada com a aprovação do Animal Care UCSF Institucional e Comitê de Uso (IACUC).
1. Dissecção da Longus do rato Digitorum Extensor (EDL) Músculo
- Executar todos os procedimentos animal, em conformidade com as diretrizes institucionais.
- Eutanásia de animais com 200 mg / kg deslocamento pentobarbital / cervical intraperitoneal apenas antes da colheita do músculo 10. A dissecção deve ser bem praticada para que o músculo pode ser colhido e montada no transdutor de tensão dentro de 15 minutos de eutanásia.
- Organizar supina carcaça na bandeja de dissecação e perna pino para bandeja.
- Sob o microscópio de dissecação, aberta pele, fáscia cuidadosamente aberto (Fig.1a), e casca tibial do tornozelo para cima para expor EDL (Fig.1b). Use gotas de solução de Ringer com lactato para manter o músculo úmido e buffer durante a colheita.
- Remover EDL, preservando como tendão tanto quanto possível em cada extremidade, e colocado em uma placa de Petri contendo solução de Ringer com lactato. Laço de sutura para cada um dos tendões do músculo (Figura 1C). É essencial que as fibras musculares não ser tocado ou perturbado durante a dissecção.
2. Montagem da EDL do rato na Faixa de Myograph Muscle
- Para esses estudos, um banho de tecido é necessário que prende o músculo ao mesmo tempo permitindo que ele se banhar em soro fisiológico à temperatura constante com oxigenação contínua. O banho é acoplado a um transdutor de força para a medição da tensão muscular. Nós empregamos um sistema integrado de banho myograph muscular tira do dinamarquês Myo Tecnologia (DMT Modelo 820MS) para esta finalidade. Além disso, um estimulador de pulsos elétricos quadrados (Modelo Grass S48) e dados da plataforma de aquisição (ADInstruments PowerLab Sistema de aquisição de dados e software LabChart) são necessários para obter, registrar e analisar mio-mecânica respostas, respectivamente. A 820MS DMT tem eletrodos de platina integrado a tampa do compartimento que estão posicionados em ambos os lados do músculo, na porção média da faixa de músculo. Myographs outras podem necessitar de cuidados específicos para a colocação do eletrodo.
- Preencha banho myograph com 5 mL de solução Krebs Henseleit 11. Quente a 25 ° C. Bolha O 2 / CO 2 (95% / 5%) através de banho por 15 minutos antes do uso.
- Use suturas para estender EDL entre pinças de myograph e segura os tendões do músculo EDL (Fig.1D, E) entre as pinças. Tenha cuidado para não prender o próprio músculo.
- Manter myograph banho a 25 ° C.
3. Myo-mecânico Análise
A. tensão Twitch
- Definir o comprimento inicial no banho para que não haja flacidez muscular.
- Determine estímulo máximo (duração 0,5 ms), ajustando a tensão, a fim de obter a tensão máxima contração muscular, em seguida, definir estímulo de 20% acima da máxima (para alcançar estímulo supramáxima). Em nossos estudos, o estímulo supramáximo é geralmente obtida em uma saída de 40 volts.
- Verifique a saída do estimulador usando um osciloscópio.
- Determinar o comprimento ideal gradualmente alongamento do músculo até que não haja aumento de tensões twitch.
- Permitir muscular para equilibrar por 3 min.
- Oferecer estímulo quadrados supramáximo (0,5 ms) no comprimento ideal usando grama S44 estimulador eletrônico e de saída de gravação.
- Record: curva de tensão twitch (P t vs tempo; Fig.2A).
B. Tétano tensão
- Permitir muscular para descansar por 3 minutos.
- Aplicar um trem de estímulos supramáximos para 300msec a 150 Hz no comprimento ideal usando grama S44 estimulador eletrônico e de saída de gravação.
- Record: tétano curva tensão (P o tempo vs; Fig.2B).
C. Força-frequência
- Permitir muscular para descansar por 3 minutos.
- Força-freqüência: aplicar trens de estímulos supramáximos aos 30, 60, 100, 140 e 160 Hz, com 3 minutos de descanso entre cada estímulo (Fig. 3). Alternativamente, os trens podem ser aplicadas 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 100, 140 e 160 Hz para uma melhor resolução em freqüências mais baixas, onde a força muda substancialmente.
- Parcela: relação força-frequência (% máxima força freqüência de estimulação vs).
D. Fadiga
- Aplicar trem de tetani curto: 60 Hz para 300 ms (ou frequência ajustada para produzir 50% do pico de força), a cada 3 segundos por 10 minutos. Por 10 minutos, a força tetânica deve recusar-se a um nível de platô de ~ 15% do valor inicial (Fig.4).
- Parcela: a fadiga de baixa freqüência (% vs tempo máximo vigor).
E. coleta de dados adicionais no final do protocolo
- Antes de desmontar o músculo do myograph, defina o muscle no tamanho ideal, conforme determinado na etapa III.A.4 e medir seu diâmetro usando uma ocular no microscópio ou com pinças. Calcular área transversal (M 2).
- Medida da massa muscular (mg), removendo suturas e pesando muscular.
- Pesar do mouse para avaliar a massa corporal (gm).
4. Cálculos
- Relação músculo: massa corporal =
massa muscular / massa corporal - Tensão Twitch, P t (mN) =
tensão máxima gerada durante a contração - Tensão twitch específico (N / cm 2) =
twitch tensão (MN) / área da seção transversal (M 2) x 10 5 N / M mN • 2 cm / 2 - Tempo para o pico de tensão (ms) =
tempo do início da contração de tensão máxima - Tempo de relaxamento (ms) =
tempo de pico de tensão para 50% do pico de tensão - Tetânica tensão, P O (MN) =
tensão máxima gerada durante o tétano - Tensão tetânica específico (N / cm 2) =
tetânica tensão (MN) / área da seção transversal (M 2) x 10 5 N / M mN • 2 cm / 2 - Taxa máxima de aumento de tétano (N / s) =
taxa máxima de aumento da tensão durante a ascensão tensão no tétano, ou seja, a inclinação máxima da curva de tensão tetânica (ou, dP O / dt) - Metade de relaxamento de tensão tetânica (ms) =
tempo da cessação da estimulação a 50% da tensão no término da estimulação - Twitch tensão-to-tetânica relação de tensão, P t / P O =
máxima contração tensão tetânica tensão / máximo - Índice de fadiga =
relação de tensão após dois minutos de fadiga de baixa freqüência para tensão isométrica máxima
5. Resultados representante
Figura 1. Dissecção do músculo EDL. A exposição, de hindlimb muscles.TA, tibial anterior. B, Exposição de EDL muscular (extensor longo dos dedos). C, Anexo de sutura para tendões EDL. D, banho Tension transdutor (vista do lado). E, EDL montados em banho (vista de cima). O músculo em forma incompleta imerso no buffer para fins ilustrativos, na prática, o músculo deve ser completamente imerso para evitar que sequem.
Figura 2. Exemplo de curvas de tensão. Um exemplo, da curva de contração tensão ilustrando a tensão máxima contração (P t), tempo de contração (TC) e tempo de relaxamento (HRT). Bar, 1s. B, Exemplo de curva de tensão tetânica mostrando a tensão tetânica máxima (P o) e meia-relaxamento da tensão tetânica (HRTT). Bar, 1s.
Figura 3. Exemplo de força de análise de frequências de relacionamento. A tensão, gerada por freqüências de estímulo incremental. B, Exemplo de trem de pulsos em 30MHz. Bar, 80ms. C, Exemplo de trem de pulsos em 140MHz. Bar, 80ms. D, Exemplo de força-freqüência curva de derivados de dados mostrados na A. A forma da curva força-frequência é característica da força muscular, e pode ser comparado entre os músculos de animais diferentes.
Figura 4. Exemplo de análise de fadiga de baixa freqüência. A tensões, decrescente gerados ao longo do período de stimulation.Examples baixa freqüência de trens de pulso em pontos de tempo indicado (B, C, D) são apresentados abaixo. E, Exemplo de curva de baixa freqüência fadiga derivada de dados mostrado na A. A forma da curva de fadiga de baixa freqüência é característica de força muscular, e pode ser comparado entre os músculos de animais diferentes.
Discussão
Descrevemos uma abordagem detalhada para avaliar mio-mecânicas no músculo explantado hindlimb do mouse. A EDL, enquanto mais difícil de dissecar por causa de sua posição posterior atrás do músculo tibial anterior, é mais fácil de avaliar que o tibial anterior devido à sua proeminente anexos tendinosa ao tornozelo e joelho. Esses tendões facilitar a montagem na myograph strip muscular. Em contraste, a mais facilmente acessada tibial anterior tem um anexo, ampla quase atendinous na articulação do joelho, tornando-se extremamente difícil tanto para dissecar, sem comprometer o músculo, e montar com segurança no myograph. Destacamos ainda que rapidamente a montagem do músculo em um banho de oxigenada em solução fisiológica e temperatura é essencial para preservar as propriedades mecânicas do músculo. Descobrimos que podemos repetir esta análise para até 30 minutos sem mudanças significativas na resposta do músculo sob essas condições. Finalmente, é essencial que as fibras musculares não ser tocado durante a dissecção e processos de montagem, pois isso pode ter efeitos adversos sobre a função muscular, e resultam em subestimação de mio-mecânico força. Seguindo estes procedimentos, esta análise fornece uma abordagem robusta quantitativa para avaliar os efeitos da modificação genética na função muscular 6,7,8,9, bem como a comparação entre intervenções terapêuticas em modelos do rato da doença muscular 1,2,3,5 .
Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por um Serviço de Saúde Pública Grant (HL086513) de NHLBI a PEO, e uma bolsa de pesquisa abrangente do Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (RC1-00104), um Serviço de Saúde Pública Grant (HL085377) de NHLBI, e um presente da Fundação Pollin para HSB
SC foi apoiado por uma California Institute for Bridges Medicina Regenerativa de Stem Prêmio Célula de Investigação (TB1-01194) para San Francisco State University.
Materiais
Soluções e Mídia
Solução de Ringer com lactato
- 100 mM NaCl
- 30 mM CH3CH (OH) COONa (lactato de sódio)
- 4 mM KCl
- 1 mM CaCl 2 2H 2 O (cloreto de cálcio dihidratado)
- ajustar o pH a 6,75
Krebs Henseleit solução
- 118 mM NaCl
- 4,7 mM KCl
- 1,25 mM CaCl 2
- 1,2 mM MgCl 2
- 1,2 mM KH 2 PO 4
- 25 mM NaHCO 3
- 11 mM de glicose
- ajustar o pH para 7,2-7,4 por equilibrar com O 2 / CO 2 (95% / 5%) de gás
Pentobarbital
- 5 mg / mL solução de trabalho em água estéril
Referências
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Reimpressões e permissões
