Purificação de Citometria de Fluxo de células de camundongo meiótica

Resumo

Um método eficiente para obter altamente purificada viável frações meiótica de testículo do rato é descrito, que combina uma refinada célula dissociação protocolo com fluorescentes separação de células ativadas (FACS). Este método tira vantagem de diferenças no conteúdo de DNA nuclear e densidade de frações discretas meiótica.

Resumo

A natureza heterogênea de tipos de células nos testículos e na ausência de modelos de cultura de células meióticas foram obstáculos significativos para o estudo dos programas de diferenciação únicos que se manifestam durante a meiose. Dois principais métodos foram desenvolvidos para purificar, em diferentes graus, várias frações meiótica de ambos os adultos e animais jovens: elutriação ou Staput (sedimentação), utilizando BSA e / ou gradientes de Percoll. Ambos os métodos dependem do tamanho das células e densidade para separar células meióticas ^1-5. No geral, exceto para populações de células poucos ^6, estes protocolos não ceder pureza suficiente das inúmeras populações de células meióticas que são necessários para análises detalhadas molecular. Além disso, com tais métodos geralmente um tipo de células meióticas podem ser purificada em um determinado momento, o que adiciona um nível extra de complexidade quanto à reprodutibilidade e homogeneidade quando se comparam amostras de células meióticas.

Aqui, nós descrevemos um método refinado que permite facilmente visualizar, identificar e purificar as células meióticas, a partir de células germinativas de espermátides arredondadas, usando FACS combinado com coloração Hoechst 33342 ^7,8. Este método oferece um instantâneo global de todo o processo meiótico e permite altamente purificar as células viáveis ​​da maioria fase da meiose. Estas células purificadas podem ser analisados ​​em detalhe para mudanças moleculares que acompanham a progressão através da meiose, por exemplo, mudanças na expressão gênica ^9,10 ea dinâmica de ocupação nucleosome em hotspots de recombinação meiótica ^11.

Protocolo

Este protocolo pode ser separado em duas etapas principais: (1) a dissociação e Hoechst 33342 coloração de células de camundongo testículos seguido, se necessário, (2) FACS triagem das frações relevantes meiótica, incluindo todas as fases da meiose, a partir de células germinativas de espermátides arredondadas. Depois de coletados, essas populações altamente enriquecido meiótica pode ser usado para uma ampla gama de análise. Este protocolo descreve a dissociação de um testículo adulto; volumes pode ser adaptado para os jovens ou para testes adicionais.

1. Testículo dissociação

1. Coloque um testículo decapsulated em um tubo de 15 ....

Discussão

O protocolo aqui apresentado permite, simultaneamente, purificar a partir de camundongos machos adultos toda a gama de células estágio meiótico com pureza muito elevado, permitindo que os pesquisadores para estudar a dinâmica deste processo fundamental. Células purificadas podem ser usados ​​para inúmeras aplicações que vão desde extração de RNA ^9,10, mapeamento nucleosome ^11, detecção molécula recombinante, análises de proteínas, e muitos mais. No entanto, métodos de detecção devem ser adaptadas à.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Colagenase Tipo-1	Worthington Biochemical	CLSS1	Dissolver em GBSS até 12.000 U/ml, armazenar a 4°C
Tripsina	Worthington Biochemical	TRL3	Dissolver em HCl 1 mM até 50 mg/ml, armazenar a 4°C
H–chst 33342	Acros Organics	230001000	Solução saturada (10 mg/ml em DMSO), armazenar a 4°C
DNAse I	Sigma-Aldrich	DNEP	Dissolver em água/glicerol 50% até 1 mg/ml, armazenar a -20°C
Solução Salina Balanceada de Gey’s	Sigma-Aldrich	G9779
Pipeta de Transferência de 6"	Fisher Scientific	137119D