Nós demonstramos uma In vivo Protocolo de eletroporação para transfecting aglomerados único ou pequeno de células ganglionares da retina (RGCs) e outros tipos de células da retina em ratos pós-natal em uma ampla faixa de idades. A capacidade de rótulo e manipular geneticamente RGCs pós-natal In vivo É uma ferramenta poderosa para estudos de desenvolvimento.
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Artigo de método
Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação
Neste artigo
Resumo
Resumo
A segmentação e refinamento das projeções para o mesencéfalo RGC é um sistema de modelo popular e poderosa para o estudo de como os padrões precisos de forma a conectividade neural durante o desenvolvimento. Em camundongos, as projeções retinofugal estão dispostos de uma forma topográfica e forma dos olhos específicas camadas no núcleo geniculado lateral (dLGN) do tálamo e colículo superior (SC). O desenvolvimento desses padrões precisos de projeções retinofugal tem sido tipicamente estudados pela rotulagem populações de RGCs com corantes fluorescentes e marcadores, tais como peroxidase 1-4. No entanto, estes métodos são muito grosseiro para fornecer informações sobre alterações de desenvolvimento em cada morfologia arbor RGC axonal que são a base da formação do mapa retinotopic. Eles também não permitem a manipulação genética de RGCs.
Recentemente, a eletroporação tornou-se um método eficaz para proporcionar o controle espacial e temporal preciso para entrega de moléculas carregadas na retina 11/05. Atuais protocolos de eletroporação da retina não permitem a manipulação genética eo rastreamento de projeções retinofugal de um único cluster ou pequena de RGCs em ratos pós-natal. Tem sido argumentado que a pós-natal em eletroporação in vivo não é um método viável para transfecting RGCs desde a rotulagem de eficiência é extremamente baixa e, portanto, requer a segmentação em idades embrionárias quando progenitores RGC são submetidos a diferenciação e proliferação 6.
Neste vídeo nós descrevemos um protocolo de eletroporação in vivo para a entrega prevista para genes, shRNA, e dextranos fluorescentes para RGCs murino pós-natal. Esta técnica proporciona um custo efetivo, rápido e relativamente fácil para plataforma de triagem eficiente de genes candidatos envolvidos em vários aspectos do desenvolvimento neural, incluindo retração axônio, ramificação, laminação, regeneração e formação de sinapses em vários estágios de desenvolvimento do circuito. Em resumo, descrevemos aqui uma valiosa ferramenta que irá fornecer mais ideias sobre os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento mapa sensorial.
Protocolo
1. Equipamentos de Set-up para Eletroporação
- Eletrodos: Nós modificamos Dumont # 5 pinça para uso como eletrodos.
- Separar e dividir o fórceps.
- Um fio de solda na ponta mais larga de cada dente. Enrole o fio ligado e dentes com fita isolante deixando aproximadamente 25-30 mm da ponta dos dentes expostos.
- Coloque a pinça modificada para trás junto com qualquer espaçador de plástico adequado (por exemplo um botão) entre os dois pinos para fornecer a ação da mola.
- Equipamentos elétricos: Usamos um estimulador elétrico para entregar pulsos de corrente para eletroporação e um monitor de áudio e o....
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Discussão
Neste vídeo mostramos um protocolo de eletroporação in vivo que resulta em rotulagem de clusters único ou pequeno de neurônios da retina em ratos pós-natal com as construções de DNA que codificam proteínas fluorescentes. Pequenos grupos de fluorescente etiquetado projeções para o RGC dLGN e SC reproduzida padrões projeção semelhante como estudos anteriores usando rotulagem RGC com corantes lipofílicos, indicando que eletroporação não interferiu normais RGC refinamento arbor axônio. Nós utilizamos esse protocolo.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
O plasmídeo pCAG-gapEGFP foi um presente do Dr. S. McConnell (Stanford, CA). pCAG-tdTomato plasmídeo foi um presente do Dr. M. Feller (Berkeley, CA). Agradecemos ao Dr. Edward Ruthazer para sugerir o uso de uma estratégia de duas plasmídeo para a rotulagem única célula e Schohl Anne (Montreal, QC) para validar os dois plasmídeo estratégia Cre / loxP em estudos-piloto e membros de laboratório Crair para suporte técnico. Apoiada por R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) e NIH P30 EY000785 (MC).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Materiais | Companhia | Número de catálogo | |
| Dumont # 5 Pinça | Multa Ferramentas Ciência | 11252-20 | |
| Estimulador elétrico | Instrumentos grama | Modelo S4 | |
| Osciloscópio | Agilent | Modelo 54621A | |
| Áudio do monitor | Instrumentos grama | Modelo AM8B | |
| Puxador | Sutter Instruments | Modelo P-97 | |
| Vannas Scissors um | Precision Instruments mundo | 14003 | |
| Micro Tesoura b | Ted Pella | 1347 | |
| Dumont AA Pinça c | Multa Ferramentas Ciência | 11210-20 | |
| Nanoinject II Sistema | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Pipetas de vidro | Drummond Scientific | 3-000-203-G / X | |
| Pedal | Drummond Scientific | 3-000-026 | |
| Óleo mineral | Sigma-Aldrich | M3516 | |
| DII | Invitrogen | D-383 | |
| N, N-Dimetilformamida | Sigma | D4551 |
Referências
- Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields. Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).
- McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O'Leary, D. D. Retinotopic map refinement....
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Reimpressões e permissões
