Sinalização da insulina conservada caminhos encontrados na mosca da fruta Drosophila melanogaster Fazer este organismo uma ferramenta potencial para a modelagem de doenças metabólicas, incluindo diabetes tipo II. Para este fim, é fundamental para estabelecer ensaios fisiológicos para medir efetivamente a ação da insulina sistêmica na eliminação de glicose periférica na mosca adulta.
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Artigo de método
Injeção de insulina e Extração de hemolinfa para medir a sensibilidade à insulina em adultos Drosophila melanogaster
Neste artigo
Resumo
Resumo
Conservado nutrientes mecanismos de detecção existem entre mamíferos e mosca das frutas, onde os peptídeos semelhante à insulina e glucagon mamíferos, respectivamente a função de manter a homeostase da glicose durante o desenvolvimento 1,2 estágios larval. Estudos sobre moscas em grande parte pós-mitóticas adultos revelaram perturbação da homeostase da glicose como o resultado da ablação genética de insulin-like peptide (ILP), produzindo células (IPCs) 3. Assim, as moscas de fruta adultos são uma grande promessa como um sistema modelo adequado genética para doenças metabólicas, incluindo diabetes tipo II. Para aprofundar o sistema de mosca da fruta, comparável ensaios fisiológicos usados para medir a tolerância à glicose ea sensibilidade à insulina em mamíferos deve ser estabelecida. Para este fim, temos recentemente descrito um procedimento novo para medir a resposta de tolerância oral à glicose na mosca adulta e demonstraram a importância de IPCs adulto na manutenção da homeostase da glicose 4,5. Aqui, temos um procedimento modificado descrito anteriormente para a injeção de insulina 6 e isso combinado com um novo método de extração hemolinfa para medir a sensibilidade periférica à insulina na mosca adulta. Excepcionalmente, o nosso protocolo permite medições fisiológicas direta da capacidade da mosca adulta de dispor de uma carga de glicose periférica após a injeção de insulina, uma metodologia que viabiliza a caracterizar mutantes sinalizadora de insulina e intervenções potenciais que afetam a tolerância à glicose ea sensibilidade à insulina na mosca adulta.
Protocolo
1. Preparação da solução de insulina
- Preparar a solução de insulina bovina fresca pela dissolução de insulina em PBS para atingir a concentração de 0,01 mg / ml. Tanto a insulina / PBS e soluções de controle PBS deve ser mantido no gelo durante todo o procedimento de injeção. Estas soluções devem ser preparadas com 0,5% (v / v) FD & C no Blue. Um corante alimentar.
2. Preparação da agulha e injeção de Set-up
- Prepare agulhas capilar de vidro usando uma micropipeta puller.The seguintes configurações extrator produzir agulhas de qualidade suficiente para injecção: Calor, 345; Pull, 210; velocidade, 100; Time, 200 ....
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Discussão
A técnica descrita neste relatório é potencialmente útil em qualquer estudo que investiga os processos fisiológicos, resultando em alterações detectáveis em Drosophila composição hemolinfa. Ao combinar a injeção e coleta de hemolinfa desta forma, é possível verificar os efeitos imediatos fisiologicamente relevantes de um determinado tratamento experimental ou manipulação. A principal vantagem desta "sangria" técnica na coleta de hemolinfa em relação às técnicas anteriores envolvendo decapitação
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por concessões do NIA para YW.CF (AG21068, AG31086).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente / equipamentos | Companhia | Número de catálogo | |
| Insulina bovina | Sigma | I5500 | |
| Infinito Reagente glicose | Thermo Electron Corporation | TR1541 | |
| Manual microinjetor | Instrumento Sutter | ||
| P-87 Flamming / Brown micropipeta extrator | Instrumento Sutter | ||
| Único vidro de borosilicato barril capilar | Sistemas de AM | 626000 | |
| FD & C Azul No. 1 | McCormick & Company | ||
| 1 ml tubos microcapilar | Drummond | ||
| Três eixos micromanipulador manual e base de | Precision Instruments mundo |
Referências
- Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296, 1118-1118 (2002).
- Kim, S. K., Rulifson, E. J. Conserved mechanisms of glucose sensing and regulation by Drosophila corpora c....
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Reimpressões e permissões
