Medição de Coesão agregados por tensiometria superfície do tecido

Resumo

Nós descrevemos um método de medir energia de ligação, expressável como tensão superficial do tecido, entre as células dentro do tecido 3D-como agregados. Diferenças na tensão superficial do tecido têm demonstrado correlação com invasão do pulmão, músculos e tumores cerebrais, e são determinantes fundamentais de estabelecer relações espaciais entre diferentes tipos celulares.

Resumo

Medição rigorosa de energia de ligação intercelular só pode ser feita através de métodos baseados em princípios termodinâmicos em sistemas em equilíbrio. Nós desenvolvemos tensiometria tecido da superfície (TST) especificamente para medir a energia livre de superfície de interação entre as células. Os conceitos biofísicos subjacentes TST têm sido descritos anteriormente em ^1,2 detalhe. O método é baseado na observação de que células mutuamente coesa, se mantida em agitação cultura, espontaneamente montar em clusters. Ao longo do tempo, esses grupos irão arredondar para cima para formar as esferas. Este comportamento arredondamento imita o comportamento característico de sistemas líquidos. Energia de ligação intercelular é medido através da compressão agregados esférico entre placas paralelas em um tensiômetro de superfície de design personalizado tecido. A mesma equação matemática usada para medir a tensão superficial de uma gota de líquido é usado para medir a tensão superficial do tecido 3D-como agregados esféricos. O equivalente celular de tensão superficial líquido é energia de ligação intercelular, ou, mais geralmente coesividade tecidos,. Estudos anteriores de nosso laboratório mostraram que a tensão de superfície de tecido (1) prevê como dois grupos de células embrionárias vão interagir uns com os outros ^1-5, (2) pode influenciar fortemente a capacidade dos tecidos para interagir com biomateriais ^6, (3) pode ser alterada, não só através da manipulação direta da caderina-base da coesão intercelular ^7, mas também pela manipulação de moléculas-chave ECM, como FN ^11/08 e 4) se correlaciona com o potencial invasivo de câncer de pulmão ^{12, 13} fibrossarcoma, tumor cerebral ¹⁴ e tumor de próstata linhagens de células ^15. Neste artigo vamos descrever o aparelho detalhe, os passos necessários para gerar esferóides, para carregar o esferóides na câmara de tensiômetro, para iniciar a compressão agregado, e analisar e validar as medições de superfície de tecido tensão gerada.

Protocolo

1. Preparação agregado para a medição da tensão superficial do tecido.

Para células aderentes, esferóides podem ser formadas usando o método da gota pendente ou através da geração de uma folha coerente de células que podem então ser cortada em fragmentos 1 mm.

Formação de agregados pelo método de gota em suspensão:

1. Quase confluentes culturas de células aderentes devem ser cultivadas a confluência de 90%, quando então monocamadas devem ser lavados duas vezes com PBS. Depois de drenar bem, adicionar 2 ml (para 100 placas mm) de 0,05% de tripsina-EDTA 1 mM, e incubar a 37 ° C até que as células detach. Pa....

Discussão

Medir a coesão agregado pelo TST é relativamente simples. Há, no entanto, passos-chave que devem ser dominados, a fim de gerar dados TST utilizável; 1) agregados deve ser "saudável". Isto pode ser controlado, garantindo que a formação de agregados começa com as células que estão na confluência ideal antes de desapego. Tamanho agregado eo tempo na cultura também deve ser controlado para minimizar o desenvolvimento de um núcleo necrótico dentro do agregado; 2) Outro parâmetro que pode influenciar as medições TST.......

Materiais

• água do banho / agitador (New Brunswick Scientific, Edison, NJ)
• 10 ml de fundo redondo de balões (Belco, Vineland, NJ)