Apresentamos nosso protocolo nucleofection high-throughput otimizado como uma forma eficiente de transfecting humanos primários derivados de monócitos com células dendríticas ou DNA plasmídeo ou siRNA sem causar maturação das células. Nós ainda fornecer provas para silenciar siRNA sucesso do gene alvo RIG-I em ambos os mRNA e os níveis de proteína.
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Artigo de método
Protocolo otimizado para transfecção eficiente de células dendríticas, sem maturação das células
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células dendríticas (DCs) podem ser considerados sentinelas do sistema imune que desempenham um papel fundamental no seu início e resposta à infecção 1. Detecção de antígeno patogênicos por DCs naïve é através de receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) que são capazes de reconhecer estruturas específicas conservadas referido como patógeno-padrões moleculares associados (PAMPs). Detecção de PAMPs por DCs desencadeia uma cascata de sinalização intracelular, resultando em sua ativação e transformação para DCs maduras. Este processo é normalmente caracterizada pela produção de interferon tipo 1, juntamente com outras citocinas pró-inflamatórias, upregulation de marcadores da superfície celular como MHCII e CD86 e migração da DC maduro para os linfonodos de drenagem, onde a interação com as células T inicia a resposta imune adaptativa 2, 3. Assim, DCs ligação dos sistemas imune inata e adaptativa.
A capacidade de dissecar as redes moleculares subjacentes DC resposta a vários patógenos é fundamental para uma melhor compreensão da regulação destas vias de sinalização e seus genes induzidos. Ele deve também ajudar a facilitar o desenvolvimento de DC baseado em vacinas contra doenças infecciosas e tumores. No entanto, esta linha de pesquisa tem sido severamente impedido pela dificuldade de transfecting DCs primários 4.
Métodos de transdução de vírus, como o sistema lentiviral, são normalmente utilizados, mas carregam muitas limitações, como a complexidade e bio-perigosos risco (com os custos associados) 5,6,7,8. Além disso, a entrega de produtos do gene viral aumenta a imunogenicidade dos transduzidas DCs 9,10,11,12. Eletroporação tem sido usado com resultados mistos 13,14,15, mas somos os primeiros a relatar o uso de um protocolo de transfecção de alto rendimento e demonstrar conclusivamente a sua utilidade.
Neste relatório, resumem um protocolo otimizado comercial para high-throughput transfecção de DCs humanas primárias, com limitada toxicidade celular e uma ausência de maturação DC 16. Eficiência de transfecção (GFP de plasmídeo) e viabilidade celular foram mais de 50% e 70%, respectivamente. FACS análise estabeleceu a ausência de aumento da expressão do CD86 e marcadores de maturação MHCII em células transfectadas, enquanto qRT-PCR não demonstrou upregulation de IFNβ. Usando este protocolo eletroporação, que fornecem evidências de sucesso da transfecção com siRNA DCs e eficaz knock down do gene alvo RIG-I, um receptor de reconhecimento chave viral 16,17, em ambos os mRNA e os níveis de proteína.
Protocolo
1. O programa Amaxa 96 poços Nucleofector shuttle
- Abra um arquivo novo parâmetro.
- Selecione o número de poços que será utilizado para a transfecção padrão, arrastando o cursor sobre o diagrama de placa de 96 poços. Use um mínimo de três poços para piscina para cada amostra experimental.
- Introduza o código do programa: em part1 selecionar 'FF' e em part2 selecionar '168 'do pull down menus
- De 'monócitos humanos, "Solução caixa de seleção
- Na Opção de Controle, selecione 'standard'.
- Clique em Aplicar.
- Para incluir um controle não-transfecção, selecione poços adicionais a partir do diagrama conforme n....
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Discussão
Transfecção eficiente de células dendríticas naïve primário é importante para a análise de elevada capacidade e engenharia reversa de celulares vias inflamatórias nesta célula-chave mediando a transição inata-imune adaptativo. No entanto, a maioria dos investigadores acham que essas células são difíceis de transfecção tanto de forma eficiente e sem a maturação das células transfecção procedimento de indução ao usar técnicas de transfecção padrão. Nós investigamos se essas limitações poderiam ser superadas através da opt.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
O projecto foi apoiado pelo NIH Contrato n º HHSN2662000500021C NIAID. Agradecemos Ming Chen por sua assistência técnica.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Equipamento / Reagente | Companhia | Catálogo # | Comentários |
| Amaxa Nucleofector de 96 poços Shuttle | Lonza | 108S0109 | Número de série |
| Amaxa Humanos monócitos de 96 poços Kit Nucleofector | Lonza | VHPA de 2007 | Contém os monócitos humanos de 96 poços Solução Nucleofector, o Suplemento de 96 poços e as Nucleocuvettes e placas |
| RIG-I siRNA | Dharmacon | L-012.511-00 | |
| SiRNA GLO | Dharmacon | D-001600-01-20 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | Suplementado com 10% SFB, 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina e estreptomicina 100 mg / ml para fazer DC meio de crescimento |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| L-glutamina | Invitrogen | 25030081 | |
| Penicilina / estreptomicina | Invitrogen | 15070063 | |
| Soro fetal bovino | HyClone | 3.070,03 | |
| As células dendríticas | New York Blood centro | DCs são purificados de casacos buffy usando um procedimento padrão |
Referências
- Reis e Sousa, C. Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity. Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).
- Bancherau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Clark, G. J.
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Reimpressões e permissões
