Imuno-fluorescência Ensaio de Leptospirose superfície exposta Proteínas

Resumo

Um método eficiente para avaliar a exposição da superfície de proteínas leptospirose é descrito. O método é projetado especificamente para evitar a ruptura da membrana externa das células frágeis leptospirose. Esta técnica exige o emprego de vários controles negativos para avaliar a integridade da membrana externa e especificidade da reação de anticorpos.

Resumo

Proteínas de superfície bacteriana estão envolvidos em contato direto com células do hospedeiro e na absorção de nutrientes do meio ambiente ^1. Por esta razão, a localização celular pode fornecer insights sobre o papel funcional de proteínas bacterianas. Localização de proteínas de superfície bacteriana é um passo fundamental para a identificação de fatores de virulência envolvidos nos mecanismos de patogenicidade.

Métodos para fracionamento ^05/02 membranas leptospirose pode ser seletivo para uma certa classe de membrana externa proteínas (OMPs), como lipoproteínas contra OMPs transmembrana e, portanto, levar a erros de classificação. Isso provavelmente é devido a diferenças estruturais e como eles estão associados à membrana exterior. Lipoproteínas são associados com as membranas através de uma interação hidrofóbica entre a porção N-terminal de lipídios (três ácidos graxos) e os fosfolipídeos bicamada lipídica ^{6, 7.} Em contraste, OMPs transmembrana são tipicamente integrados na bicamada lipídica por amphipathic β-folhas dispostas em uma estrutura barril do tipo ^{8, 9.} Além disso, a presença de uma proteína na membrana externa, não garante necessariamente que a proteína ou seus domínios estão expostos na superfície. Espiroquetas membranas externas são conhecidos por serem métodos frágil e, portanto, exigir que envolvam a manipulação suave de células e inclusão de sub-superfície da proteína controles para avaliar a integridade da membrana externa.

Aqui, apresentamos um método de ensaio de imunofluorescência (IFA) para avaliar a exposição direta da superfície de proteínas em leptospiras intacta. Este método se baseia no reconhecimento de proteínas de superfície leptospirose pelo antígeno-anticorpos específicos. Nisto, os anticorpos específicos para OmpL54 ¹⁰ são detetcted aftero ligação a nativa epitopos de superfície exposta. Comparação da reatividade de anticorpos para células intactas contra permeabilizadas permite a avaliação da distribuição celular e se ou não uma proteína é seletivamente presentes na superfície da leptospirose. A integridade da membrana externa devem ser avaliados utilizando anticorpos para uma ou mais proteínas de subsuperfície, preferencialmente localizado no periplasma.

A superfície método IFA pode ser usado para analisar a exposição da superfície de qualquer proteína leptospirose em que anticorpos específicos estão disponíveis. Tanto a utilidade e limitação do método depende se os anticorpos utilizados são capazes de se ligar a epítopos nativa. Desde que os anticorpos são freqüentemente levantadas contra proteínas recombinantes, epítopos de espécies nativas, de superfície exposta proteínas não pode ser reconhecido. No entanto, a superfície método IFA é uma ferramenta valiosa para estudar componentes de superfícies intactas bacteriana. Este método pode ser aplicado não só para leptospiras, mas também outras espiroquetas e bactérias gram-negativas. Para conclusões mais forte sobre as superfícies de exposição de OMPs, uma abordagem abrangente, envolvendo vários métodos de localização de células é recomendada ^10.

Protocolo

1. Fixação de Leptospira para lâminas de vidro

1. Leptospira interrogans é um patógeno BSL2 classe. Trabalhando com células vivas que requer tratamento adequado, como luvas, jaleco e passos de pipetagem em uma capa estéril.
2. Crescer Leptospira em EMJH medium11, suplementado com soro de coelho 1% a 30 ° C até atingirem a fase meados log-final (densidade de 5 x 10 ⁷ a 5 x 10 ⁸ células / ml) por aproximadamente 6 dias.
3. Colheita da cultura por centrifugação a ~ xg 2000 para 7 min à temperatura ambiente.
4. Retire o sobrenadante por aspiração e delicadamente ressuspender o sedimento em tampão fosfato salino ....

Discussão

Nossa superfície técnica de IFA é semelhante ao utilizado para demonstrar a exposição de superfície de vários borrelial ^{15, 16} e leptospirose ^{12, 17} proteínas. Os detalhes do método de superfície IFA aqui descritos são projetados para minimizar a manipulação de células em um esforço para manter a integridade da membrana externa, aproveitando a tendência de células Leptospira para aderir a lâminas de vidro. O método envolve uma menor concentração (2% versus 4%) de paraformaldeído, a lavagem com tamp.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Duas lâminas de vidro bem câmara	Lab-Tek	177380
Soro de coelho	Immunochemicals Rockland	D209-00-0100
Leptospira Enriquecimento EMJH	BD Difco	279510
Alexa Fluor 488 cabra anti-IgG de coelho (H + L)	Invitrogen / Molecular Probes	A-11034
Alexa Fluor 488 cabra anti-camundongo IgG (H + L)	Invitrogen / Molecular Probes	A-11029
4'6-diamidino-2-fenil-indol dicloridrato (DAPI)	Invitrogen / Molecular Probes	D1306
Prolongar meio anti-fade de Ouro de montagem	Invitrogen / Molecular Probes	P36930	Atingir a temperatura ambiente antes de usar
Vidro Fisherfinest Prêmio Cobertura	Pescador	12-544-14
Microscópio de fluorescência	Zeiss	Axioskop 40