Identificação e Análise de Progenitores rato Eritróides usando o CD71/TER119 Assay citometria de fluxo-

Resumo

Um método de citometria de fluxo para a identificação e análise molecular da diferenciação estágio específico progenitores eritróides murino e precursores, diretamente na medula recém-colhidas do mouse óssea, baço ou o fígado fetal. O ensaio baseia-se na superfície celular marcadores CD71, Ter119 e tamanho da célula.

Resumo

O estudo da eritropoiese visa compreender como as células vermelhas são formadas a partir progenitores antes hematopoiéticas e eritróide. Especificamente, a taxa de formação de células vermelhas é regulada pelo hormônio eritropoietina (EPO), cuja síntese é desencadeada pela hipóxia tecidual. Uma ameaça aos resultados tecido adequado de oxigenação em um rápido aumento da EPO, conduzindo a um aumento na taxa de eritropoiética, um processo conhecido como a resposta ao estresse eritropoiética. O aumento resultante do número de eritrócitos melhora a entrega de oxigênio nos tecidos. Uma resposta ao estresse eficiente eritropoiética é, portanto, fundamental para a sobrevivência e recuperação de condições fisiológicas e patológicas, tais como altitude elevada, anemia, hemorragia, quimioterapia ou transplante de células-tronco.

O rato é um modelo fundamental para o estudo da eritropoiese e sua resposta ao estresse. Eritropoiese rato definitiva (do tipo adulto) ocorre no fígado fetal entre os dias embrionárias 12,5 e 15,5, no baço neonatal e adulto no baço e medula óssea. Métodos clássicos de identificação de progenitores eritróides no tecido dependem da capacidade dessas células de dar origem a colônias de células vermelhas quando banhado em Epo contendo semi-sólido mídia. Sua progênie precursor eritróide são identificados com base em critérios morfológicos. Nenhum destes métodos clássicos permitir o acesso a um grande número de células em estágio de diferenciação eritróide específicos para o estudo molecular. Aqui apresentamos um método de fluxo de citometria de identificar e estudar a diferenciação progenitores estágio-específicas e de precursores eritróides, diretamente no contexto do tecido do rato recém-isoladas. O ensaio conta com os marcadores de superfície celular CD71, Ter119, e no parâmetro de fluxo de citometria de "dispersão para a frente ', que é uma função do tamanho da célula. O ensaio CD71/Ter119 pode ser usado para estudar progenitores eritróides durante a sua resposta ao estresse eritropoiética in vivo, por exemplo, em ratos ou camundongos anêmicos alojados em condições de baixo oxigênio. Também pode ser usado para estudar progenitores eritróides diretamente nos tecidos de ratos adultos geneticamente modificados ou embriões, a fim de avaliar o papel específico da via molecular modificado na eritropoiese.

Protocolo

1. Colheita de tecidos

1. Prepare tubos contendo 2-5 ml de tampão de coloração a frio (tampão fosfato (PBS), com adição de BSA 0,2% e glicose 5mM). Manter tubos em gelo antes da colheita de tecidos.
2. Camundongos abate de acordo com o protocolo aprovado apropriado (por exemplo, inalação de CO ₂ seguido por deslocamento cervical).
3. Coleta de sangue por punção cardíaca em EDTA ou heparina de coleta de sangue, tubos para posterior análise, por exemplo, do hematócrito, contagem de reticulócitos ou análise CBC.
4. Colheita do baço e ossos, colocando tecidos de cada rato em um tubo separado, preparado na etapa 1. Fácil acesso ao b....

Discussão

A metodologia de citometria de fluxo permite investigação simultânea de qualquer função celular que pode ser detectado com um anticorpo conjugado com fluorescência específica ou ligante, incluindo marcadores da superfície celular, a expressão da proteína, a sobrevivência celular, sinalização celular usando fosfo anticorpos específicos ³ e status de ciclo celular. Estas medições podem ser feitas em cada um de uma série de estágios de diferenciação subconjuntos específicos, no contexto da recém-isoladas do teci.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Fas-biotina	BD PharMingen	554256
Estreptavidina-APC	Sondas moleculares	S868
40 mM filtro célula estéril	Fisherbrand	22363547
Poliestireno de fundo redondo de tubos para a coloração FACS	BD Falcon	352008
U bottom-placa de 96 poços	BD Falcon	353910
ChromePure coelho IgG	ImmunoResearch Jackson	015-000-003
CD71-FITC (estoque 0,5 mg)	BD-Biosciences	553266
Ter119-PE (stock 0.2mg/ml)	BD-Biosciences	553673
7AAD	BD-Biosciences	559925
DAPI em pó	Roche	236276
FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30	BD PharMingen	553848
FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2	BD PharMingen	553087
FITC Rat Anti-Mouse CD411b/Mac-1 M1/70	BD PharMingen	557396
Rat FITC anti-rato Ly 6G e Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5	BD PharMingen	553126
FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11	BD PharMingen	553061
APC BrdU Fluxo de kit	BD PharMingen	557892
Anexina V-biotina	BD PharMingen	556418