Quantificação de Proteínas Usando Enriquecimento imunoafinidade Peptide Acoplado com Espectrometria de Massa

Summary

Padrões de Isótopos estáveis ​​e Captura de Anticorpos Anti-Peptide (SISCAPA) casais enriquecimento afinidade de peptídeos com isótopos estáveis ​​de diluição espectrometria de massa (MRM-MS) para fornecer a medição quantitativa de peptídeos como substitutos para suas respectivas proteínas. Aqui nós descrevemos o protocolo usando partículas magnéticas em um formato parcialmente automatizados.

Abstract

Há uma grande necessidade de ensaios quantitativos para medir proteínas. Imunoensaios sanduíche tradicional, amplamente considerado o padrão ouro na quantificação, estão associados a um alto custo, longo tempo, e estão repletas de desvantagens (por exemplo, anticorpos heterofílicos, a interferência auto-anticorpos, 'gancho-efeito "). ^Uma técnica Uma alternativa é o enriquecimento de afinidade de peptídeos acoplado com espectrometria de massa quantitativos, comumente referido como SISCAPA (Padrões de Isótopos Estáveis ​​e Captura de Anticorpos Anti-Peptide). ² Nesta técnica, a afinidade de enriquecimento de peptídeos com a diluição de isótopos estáveis ​​e detecção de selecionados / múltiplos de reação monitoramento espectrometria de massa ( SRM / MRM-MS) fornece medição quantitativa de peptídeos como substitutos para suas respectivas proteínas. SRM / MRM-MS está bem estabelecido para a quantificação precisa de pequenas moléculas ^{3, 4} e mais recentemente foi adaptado para medir as concentrações de proteínas no plasma e lisados ​​celulares. ^5-7 Para alcançar quantificação de proteínas, estas moléculas maiores são digeridos para peptídeos componente usando uma enzima, como tripsina. Um ou mais peptídeos selecionados cuja seqüência é exclusivo para a proteína-alvo, em que as espécies (ou seja, "proteotypic" peptídeos) são, então, enriquecido a partir da amostra usando anticorpos anti-peptídeo e medido como substitutos estequiométrica quantitativa para a concentração de proteína na amostra. Assim, acoplado a diluição de isótopos estáveis ​​(SID) (ou seja, um spiked-in isótopo estável rotulados peptídeo standard), SRM / MRM podem ser usados ​​para medir as concentrações de peptídeos proteotypic como substitutos para a quantificação de proteínas em matrizes biológicas complexas. Métodos Os ensaios têm várias vantagens em comparação com imunoensaios tradicional. Os reagentes são relativamente menos caro para gerar, a especificidade para o analito é excelente, os ensaios podem ser altamente multiplexados, de enriquecimento pode ser realizado a partir do plasma puro (sem esgotamento necessário), ea técnica é passível de uma grande variedade de proteínas ou modificações de interesse. ^8-13 Neste vídeo podemos demonstrar o protocolo básico, adaptado a uma plataforma magnética talão.

Protocol

Procedimento experimental:

O ensaio requer peptídeos sintéticos e anticorpos anti-peptídeo. Peptídeos selecionados deve ser exclusivo para a proteína de interesse, conter entre 8 e 22 aminoácidos, e não tem conhecido modificações pós-translacionais. Resíduos de metionina são geralmente evitada e peptídeos contendo aminoácidos dibásicos (por exemplo, KK, KR, RR) são indesejáveis. Para esta técnica, é comum o uso de peptídeos isótopo estável rotulados como normas internas, incorporando pesado ⁽¹³ C e ¹⁵ N) marcado aminoácidos no C-terminal do peptídeo (ou seja, K ou R rotulados).

O protocolo a seguir descreve um teste desenvolvido para medir a GDSLAYGLR peptídeo da proteína Osteopontina mouse, utilizando anticorpos anti-peptídeo obtido a partir de Epitomics Inc. (Burlingame, CA) e peptídeos sintéticos da Nova Inglaterra Peptide (Gardner, MA). O protocolo consiste em três etapas principais (Figura 1): 1) Tripsina digestão das proteínas complexas, 2) Enriquecimento de peptídeos 3) Análise por espectrometria de massa. Será demonstrado em uma amostra de plasma humano enriquecida com a proteína Osteopontina mouse.

1. Tripsina digestão enzimática e limpeza

1. Thaw 10 mL alíquota plasma puro em gelo molhado.
2. Determinar a concentração de proteínas totais por ensaio BCA e centrifugar a amostra para remover quaisquer sólidos em suspensão.
3. Pipeta alíquota de 10 L de seu tubo de armazenamento para uma placa Deepwell 1000 mL e cubra com pierce-able filme.
4. Adicionar 20 mL de 9M fresco uréia / 30mm ditiotreitol (DTT) (final de concentração 6M TDT uréia / 20mm) para cada amostra.
5. Incubar por 30 minutos a 37 ° C.
6. Adicionar 3 mL de iodoacetamida mM fresco 500 (IAM final de 50 mM) para cada amostra.
7. Incubar por 30 minutos no escuro à temperatura ambiente.
8. Adicionar 257 mL de 100 mM Tris (pH 8) (dilui uréia para 0,6 M ~).
9. Adicionar 10 mL de tripsina solução estoque (1 mg / mL; para 01:50 enzima: substrato).
10. Incubar 37 ° C durante a noite (12-16 horas).
11. Adicionar 3 mL de ácido fórmico pura (concentração final de 1%).
12. Adicionar padrão de isótopos estáveis ​​(padrões múltiplos são adicionados se realizar um ensaio multiplex, geralmente essa é cerca de 10 mL contendo 5-10 fmol de peptídeo isotopicamente marcado standard).
13. Lavar a placa do cartucho Oasis bem com 500 mL de 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila 80%, descartando o escoamento. Repita 3 vezes.
14. Equilibrar a placa do cartucho, adicionando 500 mL de 0,1% de ácido fórmico em água, e descartar o escoamento. Repita isso 4 vezes.
15. Carregar amostras digerir a placa do cartucho e ajustar o vácuo de modo que o fluxo é muito lento.
16. Lavar com 500 mL de 0,1% de ácido fórmico em água, e descartar por escoamento. Repita 3 vezes.
17. Peptídeos eluir pela adição de 2 x 500 mL de 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila 80% em 1000 prato fundo bem-mL (não descartam a flow-through).
18. Lyophilize (ou speedvac) o eluído até à dessecação. (Liofilização é o método preferido)
19. Reconstituir secas peptídeos pela adição de 50 mL PBS + 0,03% CHAPS.

2. Peptídeo de enriquecimento de imunoafinidade

1. Transferir a amostra a norma Kingfisher 96 placas bem.
2. Adicionar um anticorpo mg e 1,5 mL da proteína G-esferas magnéticas revestidas por alvo (que é opcional para crosslink o anticorpo para as contas antes disso). Garantir contas são bem suspenso por agitação ou vórtex.
3. Cobrir a placa com papel alumínio.
4. Incubar overnight (12-16 horas) com suave caindo para garantir contas são suspensas.
5. Centrífuga placa a 32 xg por 5 segundos para remover qualquer líquido a partir da superfície da folha.
6. Remova a cobertura de alumínio.
7. Lavagem e eluição das contas pode ser feita manualmente ou de forma automatizada. Este procedimento descreve as etapas automatizadas em uma plataforma de Kingfisher.
8. Lave as contas duas vezes com 200 mL PBS + 0,03% CHAPS (1 minuto por lavagem).
9. Lave as contas uma vez com 200 mL de diluição de 1:10 de PBS + CHAPS 0,03% (1 minuto).
10. Os peptídeos são eluídos em 25 uL de 5% de ácido acético + CHAPS 0,03%.
11. Coloque a placa de eluição em um ímã e transferir o eluato para um prato de 96 poços, tendo o cuidado de não transferir as contas sobra.
12. Cobrir a placa com um tapete de vedação.
13. A placa contendo o eluato é entregue ao espectrômetro de massas triplo quadrapole para análise.

3. Análise por monitoramento de reações múltiplas - espectrometria de massa

1. Transições para SRM / MRM análise podem ser selecionados e otimizados pela infusão de uma solução picomole 1 por microlitro do padrão de peptídeos em 30% de ácido fórmico acetonitrile/0.1% para o espectrômetro de massa de 0,5 mL / min. Uma vez de spray estável é obtido, recolher um espectro de MS / MS.
2. Transições são selecionados a partir do espectro MS / MS, identificando three íons fragmento abundantes em uma região do espectro com pouco ruído. Para multiplicar-íons carregados peptídeo, os fragmentos y-ion detectado em m / z> precursor m / z são normalmente o melhor para o SRM / MRM desenvolvimento ensaio. Figura 2 mostra o espectro de MS / MS e íons de transição selecionados 476,3> 508,3, 579,3 , 692,4 (transições para o pesado isótopo estável padrão não 481,3> 518,3, 589,3, 702,4 mostrado) para a GDSLAYGLR peptídeo.
3. Dependendo da marca e modelo do espectrômetro de massa utilizada, existem vários parâmetros que podem ser otimizados para cada transição. Aqui, nós otimizamos a energia de colisão de cada transição selecionados por ramping a energia da colisão e monitoramento do nível de sinal. A energia de colisão de 25 foi usado para cada transição.
4. Resumidamente, uma configuração típica para SRM / MRM análise é a seguinte: Fase móvel (A) ácido fórmico 0,1%, (B) acetonitrila 90% / 0,1% de ácido fórmico, 0,3 x 5 mm coluna armadilha C18, 75 mM ID x 15 cm coluna analítica C18 (Reprosil-Pur AQ C18, 120 A poros °). O volume de injeção é de 10 mL da amostra e é carregado por 5 min a B 3% a uma vazão total de 3 mL / min e eluída por um gradiente linear 3-45% B no 300-400 nL / min em 10 min. Condições em um QTRAP 4000 (ABSCIEX, Foster City, CA) foram spray de 2,3 kV de tensão, temperatura da fonte de íons de 150 ° C, GS1 de 12, e gás de cortina 15.
5. A amostra é analisada por SRM / MRM, injetando 10 mL da amostra. Áreas dos picos são integrados para peptídeos leves e pesados ​​usando o Skyline programa. ¹⁴ Calcule a razão da área de pico (PAR) do peptídeo unlabeled / rotulados em cada amostra usando a transição mais abundante que é livre de ruído de fundo, neste caso, a transição y5 (peptídeo luz 476,3> 579,3, pesado peptídeo padrão 481,3> 589,3).

4. Resultados representativos:

Medida razões das áreas de pico (em relação peptídeo luz endógena para peptídeo pesados ​​spiked isotopicamente marcado) fornecer uma medida quantitativa do peptídeo alvo. Figura 3 mostra um exemplo de cromatograma peptídeos leves e pesados ​​em uma amostra SISCAPA enriquecido. Note-se que os peptídeos leves e pesados ​​eluir no mesmo tempo e várias transições podem ser monitorados para cada peptídeo para confirmar a identidade.

Figura 1. Panorama Um esquema do processo SISCAPA. Uma mistura de proteínas complexo é digerido em peptídeos. Analitos peptídeo alvo (analito endógenos e uma spiked isótopo estável com etiqueta padrão interno) são enriquecidos com anticorpos anti-peptídeo imobilizada em proteína G-revestido partículas magnéticas. Após isolamento, os peptídeos são alvo eluída as partículas magnéticas e analisados ​​por espectrometria de massa para quantificação em relação ao padrão interno.

Figura 2. MS / MS espectro da GDSLAYGLR peptídeo mostrando seleção de três fragmentos de SRM / MRM transições.

Figura 3. Cromatogramas Exemplo mostrando o perfil de pico de um analito peptídeo de luz (vermelho) eo pesado isótopo estável com etiqueta padrão interno (azul). Cromatogramas para a transição y5 do peptídeo luz (476,3> 579,3) e de isótopos estáveis ​​pesados ​​rotulados padrão (481,3> 589,3) são plotados ao longo do tempo como eles saem da sistema de cromatografia.

Discussion

O passo mais crítico no protocolo, conforme descrito é garantir as contas permanecem bem misturado durante o período de incubação. Permitindo que as contas para se depositar no fundo do poço / frasco irá resultar em aumento da variabilidade. Também é importante para spin-down qualquer líquido que possa permanecer no topo do poço / frasco após o período de incubação. Digestão com tripsina reprodutíveis também é crítica. O procedimento para a digestão descrita aqui tem sido utilizada extensivamente em nosso laboratório em conjunto com SISCAPA, no entanto, é provável que os métodos alternativos de digestão pode ser otimizado para um determinado conjunto de proteínas-alvo ¹⁵ eluição do anticorpo livre não interfere com a detecção do. peptídeo, provavelmente porque o anticorpo é excluído da coluna ou elui mais tarde do que os peptídeos, mas o anticorpo pode ser reticulado às esferas G Protein antes de afinidade em experiências de enriquecimento de grande ou se anticorpo livre se torna um problema. Temos também que era útil para colocar um ímã sob a placa de amostra no amostrador automático, bem como lavar a coluna armadilha na direção contrária do fluxo (em comparação com a carga) para remover todas as pérolas residual ou partículas. Além da abordagem magnética talão descrito, a técnica também pode ser adaptado para um formato de coluna (ou seja, cromatografia de afinidade). ^{12, 16}

Quando o usuário está confortável com o protocolo geral, a técnica também é passível de várias modificações que melhoram o ensaio geral. ¹¹ Primeiro, é possível analisar analitos múltiplos em um único ensaio, combinando anticorpos na etapa de enriquecimento (multiplexação por exemplo). O espectrômetro de massa é capaz de analisar simultaneamente um grande número de analitos. Segundo, aumentando o volume de amostra original melhora a sensibilidade do ensaio.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do material	Companhia	Número de catálogo
1000ul placas poço profundo de 96 poços	Eppendorf	951032786
Oasis HLB 1 cc placa do cartucho, Sep-pak, 40 mg placa de 96 poços	Águas	186003966
Kingfisher placa de 96 poços	Thermo Fisher Scientific	97002540
Claro de 96 poços, placa de parede branca	Bio-Rad	HSP9601
Folha de cobertura para placa de 96 poços	Excelscientific	12-169
Axymat esteira de vedação para placa de 96 poços	Axygen	521-01-151
X furar filme	Sigma-Aldrich	Z722502
Kingfisher processador magnético talão com PCR cabeça ímã	Thermo Fisher Scientific	HSP 9601

Nome do material	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Uréia	Sigma Aldrich	U6031
Trizma base de	Sigma Aldrich	T1503
Ditiotreitol (TDT)	Perfurar	20291	"Não-pesar ditiotreitol"
Iodoacetamida (IAM)	Sigma Aldrich	I1149
Tripsina Ouro	Promega	V5280
Proteína G esferas magnéticas, 2.8um	Invitrogen	10004D
Tampão fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific	L5401
CHAPS	Thermo Fisher Scientific	28300
Ácido fórmico	EMD	11670
Acetonitrila	Thermo Fisher Scientific	A998-1
Ácido acético	Sigma Aldrich	242853

Solução	Comentários (opcional)
100 mM Tris pH 8
9 M de uréia / 30 mM DTT em 100 mM Tris (pH 8)	deve ser renovada a cada vez
IAM 500 mM em 100 mM Tris (pH 8)	deve ser renovada a cada vez
Tripsina 1mg/mL em 100 mM Tris pH 8
Inibidor de tripsina 1mg/mL em 100 mM Tris pH 8
Isótopo estável padrão Mastermix
Anti-peptídeo Mastermix anticorpos