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Artigo de método

Lentivirus mediada Durante Knockdown Ex Vivo Eritropoese de Células-Tronco Hematopoéticas

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DOI:

10.3791/2813

⸱

16 de julho de 2011

 ,  , 
1The Sprott Center for Stem Cell Research, Regenerative Medicine Program, Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa

Neste artigo

Resumo

Um Ex vivo Protocolo para gerar humano maduro glóbulos vermelhos a partir de tronco hematopoiéticas / progenitores é descrito. Além disso, descrevemos um método de entrega-lentiviral eficiente para knockdown do TAL1 fator de transcrição em células primárias eritróide. A eficiência do lentivírus de entrega gene mediada é demonstrada usando vírus GFP expressar.

Resumo

Eritropoiese é um sistema modelo comumente usado para estudar a diferenciação celular. Durante a eritropoiese, pluripotentes humano adulto células-tronco hematopoéticas (HSCs) diferenciar em progenitores oligopotent, precursores e glóbulos vermelhos maduros 1. Este processo é regulado por uma grande parte ao nível da expressão gênica, em que fatores de transcrição específicos ativar genes de linhagem específica, enquanto concomitantemente reprimindo genes que são específicos para outros tipos de células 2. Estudos sobre fatores de transcrição que regulam a eritropoiese são frequentemente realizadas usando linhas de células humanas e camundongos, que representam, até certo ponto, as células eritróides, em determinadas fases de diferenciação 3-5. Linhagens de células transformadas no entanto só pode imitar parcialmente células eritróides e mais importante é que eles não permitem que se compreensível estudar as mudanças dinâmicas que ocorrem como células progridem por muitos estágios para o seu destino eritróide final. Portanto, um desafio atual continua a ser o desenvolvimento de um protocolo para obter populações relativamente homogêneas de HSCs primária e células eritróides em vários estágios de diferenciação em quantidades que são suficientes para executar genômica e proteômica experimentos.

Aqui nós descrevemos um ex vivo protocolo de cultura de células para induzir a diferenciação eritróide de humano-tronco hematopoiéticas / progenitoras que foram isolados a partir de qualquer sangue do cordão umbilical, na medula óssea ou sangue periférico de adultos mobilizados com G-CSF (leucaférese). Este sistema de cultivo, inicialmente desenvolvido pelo laboratório Douay 6, usa citocinas e co-cultura em células mesenquimais para imitar o microambiente da medula óssea. Usando este protocolo diferenciação ex vivo, observamos uma ampliação forte de progenitores eritróides, uma indução de diferenciação exclusivamente para a linhagem eritróide e uma maturação completa para o estágio de enucleados células vermelhas do sangue. Assim, este sistema oferece uma oportunidade para estudar o mecanismo molecular de regulação da transcrição como células-tronco hematopoiéticas progresso ao longo da linhagem eritróide.

Estudando eritropoiese no nível de transcrição também requer a capacidade de sobre-expressar ou knockdown fatores específicos em células primárias eritróide. Para este fim, usamos um lentivírus mediada sistema de entrega de gene que permite a infecção eficiente de ambos dividindo e não dividir células 7. Aqui nós mostramos que somos capazes de forma eficiente o knockdown TAL1 fator de transcrição em células primárias de eritróide humana. Além disso, a expressão GFP demonstra uma eficiência de infecção lentiviral cerca de 90%. Assim, o nosso protocolo prevê um sistema altamente útil para a caracterização da rede de regulação de fatores de transcrição que eritropoiese controle.

Protocolo

Parte I. Eritropoese ex vivo de células-tronco/progenitoras hematopoiéticas humanas

1. Isolamento de células-tronco/progenitoras hematopoéticas humanas CD34+

A população de células CD34+ humanas, que contém uma mistura de células-tronco hematopoiéticas (CTHs) e progenitores precoces 8, é obtida a partir de sangue de cordão umbilical, sangue periférico mobilizado com G-CSF (leucoaférise) ou medula óssea (Figura 1 - Etapa 1). Se utilizar sangue de cordão ou sangue periférico, vá diretamente para a etapa 1.2. Se utilizar medula óssea, inicie na etapa 1.1. Para reagentes e equipamentos, consulte a Tabela 1.

Este passo é realizado em condições estéreis (ou seja, capela) e à temperatura ambiente (RT), salvo indicação em contrário.

  1. Prepare uma suspensão de células isoladas da medula óssea:
    1. Resuspenda a medula em 10 volumes de RPMI 1640 contendo 0,02% de colagenase B e 100 U/mL de DNase 1
    2. Misture suavemente em um agitador de balança durante 45 min.
    3. Filtre as células através de uma malha de náilon de 30 μm.
  2. Isolar células mononucleares (MNCs) de baixa densidade por centrifugação em gradiente de densidade de Ficoll:
    1. Dilua a suspensão de sangue ou medula com 2-4 volumes de PBS contendo 2% de soro bovino fetal (FBS) e 2 mM de EDTA. N.B. Volumes maiores aumentam a pureza das CMM.
    2. Em um tubo cônico de 50 ml, sobrepor cuidadosamente 35 ml da suspensão celular diluída sobre 15 ml de Ficoll-paque. Centrifugar a 400g durante 30 min. em rotor de braço oscilante sem freio.
    3. Aspire a camada superior, mantendo a camada intermediária de MNCs inalterada.
    4. Transfira a camada de interface (contendo as MNCs) para um novo tubo cônico de 50 ml.
    5. Adicione PBS contendo 2% de FBS e 2 mM de EDTA para completar este tubo, misture suavemente invertendo o tubo e centrifugue a 300g durante 10 min a temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante.
    6. Lave o pellet celular mais 2 vezes para remover plaquetas. N.B. Esta etapa aumenta a pureza de CD34+ células
    7. Tome 20 μl de suspensão celular e coloque em um tubo eppendorf. Adicione 200 μl de tampão de lise de hemácias (Tabela 1) e incube à temperatura ambiente por 2 min. Coloque 18 μl dessa suspensão sob uma hemocitômetro e conte as MNC nucleadas.
    8. As MNCs podem ser usadas imediatamente ou congeladas a 108 célula/ml em meio de cultura celular contendo 10% de DMSO e armazenado em nitrogênio líquido.
  3. Isolar CD34+ células por seleção imunomagnética positiva (Figura 1-Passo 1)
    Utilizamos o Kit de Microesferas CD34 (contendo uma solução de microesferas conjugadas a anticorpos monoclonais de camundongo anti-CD34 humano e uma solução de Reagente Bloqueador de FcR contendo IgG humana) em combinação com duas colunas LS Mini-MACS, o AutoMACS Running Buffer e um Separador MiniMACS (Tabela 1). Abaixo descrevemos nosso protocolo a partir de 2,3x10⁸8 MNCs. Se forem utilizados números diferentes de células, os volumes devem ser aumentados ou reduzidos proporcionalmente. Além disso, para até 2x108 MNCs podem ser utilizados em uma coluna MS MiniMacs em vez de uma coluna LS MiniMacs.
    Mantenha as células e os reagentes frios (4-8 °C) para evitar a captação de anticorpos na superfície celular e a marcação celular inespecífica.
    1. Resuspenda o pellet contendo 2,3x108 MNCs em 690 μl de Running Buffer (300 μl por 108 MNCs, sendo 300 μl o volume mínimo de suspensão necessário) e transferir para um tubo cônico de 15 ml.
    2. Adicione 230 μl do Reagente Bloqueador de FcR
    3. Adicione 230 μl da solução de CD34 MicroBeads.
    4. Misture bem manualmente e incube por 30 min. a 4 °C.
    5. Lave as células adicionando 10 ml de tampão de corrida e centrifugue a 300g durante 10 min.
    6. Aspire completamente o sobrenadante.
    7. Resuspenda as células em 1,2 ml de Tampão de Corrida (utilize 0,5 ml de tampão por 108 MNCs N.B. É importante obter uma suspensão de células simples antes da separação magnética. Se necessário, passe as células por uma malha de náilon de 30 μm para remover agregados celulares.
    8. Prepare a coluna LS colocando-a no campo magnético de um separador MiniMACS.
    9. Lave a coluna com 3 ml de Tampão de Corrida.
    10. Aplique 1,2 ml da suspensão celular na coluna.
    11. Colete o fluxo e utilize-o para verificar o rendimento e a pureza das células CD34+ isolamento celular. Alternativamente, congele as células contidas nesta fração e armazene-as em nitrogênio líquido. N.B Esta fração contém células não marcadas e também pode conter algumas células CD34 marcadas+ células que não se ligaram à coluna.
    12. Lave a coluna três vezes com 3 ml de Tampão de Corrida, reúna as lavagens e utilize esta fração de maneira semelhante à fração do fluxo inicial descrita acima.
    13. Retire a coluna do ímã e coloque-a em um tubo coletor de polipropileno de 15 ml.
    14. Para eluir as células, adicione 5 ml do Tampão de Corrida na coluna e imediatamente elua as células CD34 marcadas+ células pressionando firmemente o êmbolo na coluna.
    15. Repita o procedimento de purificação em coluna (passos h a n) passando as células por uma coluna LS recém-preparada. N.B. Isso aumenta a pureza de CD34+ células. De uma suspensão de 2,3x108 MNCs isoladas por leucoaférese, tipicamente obtemos 1,1x106 CD34+ células com uma pureza > 95±3% (Figura 1-Etapa 1).
    16. Congele as células em meio de cultura contendo 10% de DMSO e armazene em nitrogênio líquido ou prossiga diretamente para o passo 2).

2. Diferenciação eritróide em cultura celular

As células CD34+ são cultivadas em meio IMDM suplementado com fornecimento sequencial de hidrocortisona e combinações específicas de citocinas de acordo com um protocolo de quatro etapas adaptado de 6 (Figura 1-Etapa 2). Uma série de testes é realizada ao longo do procedimento para verificar o crescimento celular e a diferenciação eritróide.

O número de células CD34+ necessário para iniciar um cultivo é variável, dependendo da escala do experimento. Normalmente, para estudos de expressão gênica, realizamos um cultivo em pequena escala, iniciando com 0,1x106 células CD34+ em 10 ml de meio e mantendo volumes pequenos mediante o congelamento de células excedentes ao longo do procedimento. Para estudos nos quais é necessária a extração de proteínas, os cultivos são realizados em maior escala. Aqui descrevemos um experimento em larga escala no qual iniciamos com cerca de 7x106 células CD34+ isoladas de leucoaférise.
Condições estéreis são utilizadas durante todo o processo. Consulte as Tabelas 1, 2 e 3 para obter informações sobre os reagentes.

  1. Preparar reagentes
    1. Prepare o meio IMDM suplementado conforme descrito na Tabela 2 e congele alíquotas de 40 ml a -20°C (pode ser feito com antecedência).
    2. Prepare soluções estoque de hidrocortisona e citocinas conforme descrito na Tabela 3.
  2. Passo 1: Dias 0-11
    Células hematopoiéticas são cultivadas em meio IMDM suplementado contendo hidrocortisona (HC), fator de células-tronco (SCF), interleucina 3 (IL-3) e eritropoietina (EPO) (Tabela 3). Células estromais da medula óssea murina MS-5 (Tabela 1) são amplificadas em preparação para o Passo 2.
    • Dia 0:
      1. Pré-aqueça 120 ml de meio IMDM suplementado e adicione HC, SCF, IL-3 e EPO (Tabela 3).
      2. Descongele 7x106 células CD34+ colocando primeiro o(s) frasco(s) em banho-maria a 37°C. Enquanto as células ainda estiverem congeladas, adicione 1 ml de meio pré-aquecido e transfira as células para um tubo cônico de 15 ml. Lave o frasco com 2 ml de meio e transfira para o tubo de 15 ml.
      3. Adicione 6 ml de meio à suspensão celular, misture invertendo o tubo e centrifugue a 200 g por 5 min.
      4. Aspire o sobrenadante e re-suspenda o pellet celular em 10 ml de meio fresco.
      5. Conte as células vivas usando um hemocitômetro após misturar 10 μl de suspensão celular com 10 μl de solução de Azul de Tripano (Tabela 1). NB: A morte celular é cerca de 25% durante o descongelamento, portanto a concentração de células vivas deve ser ~0,5x106 células/ml.
      6. Reserve aproximadamente 3 ml da suspensão celular para testes (ver parágrafo 6).
      7. Transfira os 7 ml restantes para um frasco T-175 e adicione 63 ml de meio para obter 0,05x106 células/ml em 70 ml e coloque o frasco em incubadora a 37°C.
    • Dia 1:
      1. Pré-aqueça 85 ml de meio de cultura para células MS-5: αMEM com Glutamax (Tabela 1), 10% de SBF e 100 U/ml de penicilina e 100 μg/ml de estreptomicina.
      2. Prepare três placas de cultura redondas de 150 mm x 25 mm, cada uma semeada com 2x106 células MS-5 em 25 ml de meio para obter 0,08x106 células/ml e coloque em incubadora a 37°C. NB: Os melhores resultados são obtidos usando células MS-5 de baixo número de passagens (<20). Culturas confluentes devem ser expandidas dividindo-se 1:5 a cada três dias usando tripsina contendo 0,05% de EDTA.
    • Dia 2:
      1. Conte as células hematopoiéticas com Azul de Tripano para excluir células mortas e colete as células necessárias (ou seja, ~20 ml de cultura) para testes (ver parágrafo 6). NB: Em nossa experiência, durante os dois primeiros dias, a morte celular pode exceder 30-50% e, portanto, a concentração final das células geralmente é próxima à do Dia 0 (Figura 2).
      2. Substitua o meio de cultura das células MS-5 por 25 ml de meio fresco, garantindo que as células MS-5 que não aderiram sejam removidas.
    • Dia 4:
      1. Conte as células hematopoiéticas com Azul de Tripano para excluir células mortas e colete as células necessárias (ou seja, ~10 ml de cultura) para testes (ver parágrafo 6). NB: Neste ponto, as células devem ter iniciado a proliferação com >75% de células vivas a uma concentração de ~0,2x106 células/ml. As células podem ser congeladas a 1-2x106 células/ml em meio IMDM suplementado contendo 10% de DMSO e armazenadas em nitrogênio líquido.
      2. Transfira os ~40 ml restantes de cultura para um frasco T-175 e adicione meio IMDM suplementado suficiente contendo HC, SCF, IL-3 e EPO (Tabela 3) para atingir um volume final de 150 ml. NB: A concentração celular deve ser ~0,05x106 células/ml.
      3. Expanda as células MS-5 (que devem estar com 60-70% de confluência) diluindo-as 1:5 em novas placas de cultura redondas de 150 mm x 25 mm usando tripsina 0,05% EDTA. A concentração final de células deve ser ~0,08x106 células/ml. NB: Normalmente, uma placa pode ser expandida 5 vezes, de modo que você deve ter 15 placas de células MS-5 a ~0,08x106 células/ml.
    • Dia 6:
      1. Conte as células hematopoiéticas com Azul de Tripano para excluir células mortas e colete o número necessário de células (ou seja, ~5 ml de cultura) para testes (ver parágrafo 6). NB: As células estão em fase altamente proliferativa e a concentração celular deve ser mantida ≤1,5x106 células/ml. Se a concentração for maior, adicione meio IMDM suplementado fresco contendo HC, SCF, IL-3 e EPO.
    • Dia 7:
      1. Conte as células hematopoiéticas com Azul de Tripano para excluir células mortas. NB: Em nossa experiência, as células geralmente atingem uma densidade de 1,5x106 células/ml no Dia 7.
      2. Adicione meio suficiente para manter uma concentração celular de ~0,8x106 células/ml. NB: Geralmente adicionamos 100 ml de meio IMDM suplementado fresco contendo HC, SCF, IL-3 e EPO para obter 245 ml de células a ~0,8x106 células/ml.
      3. Expanda as células MS-5 (que devem estar com 60-70% de confluência) diluindo-as 1:5 em frascos T-175 (em vez de placas) usando tripsina 0,05% EDTA. A concentração final de células deve ser ~0,08x106 células/ml. NB: 61 frascos de células MS-5 a ~0,08x106 células/ml devem ser preparados. Congele as células MS-5 restantes e armazene-as em nitrogênio líquido.
    • Dia 8:
      1. Conte as células hematopoiéticas com Azul de Tripano para excluir células mortas e colete o número necessário de células (ou seja, ~5 ml de cultura) para testes (ver parágrafo 6). NB: A densidade celular deve ser ~1x106 células/ml.
      2. Pré-aqueça 2 L de meio IMDM suplementado contendo apenas SCF e EPO (Tabelas 2 e 3).
      3. Coleta 200 ml de cultura hematopoietica (contendo ~200x106 células), centrifugue a 200 g por 10 min., aspire o sobrenadante e re-suspenda o pellet celular em 40 ml de meio IMDM suplementado contendo SCF e EPO.
      4. Distribua a suspensão celular em 8 frascos T-175 (5 ml por frasco) e adicione 245 ml de meio IMDM suplementado contendo SCF e EPO a cada frasco. NB: Agora temos 8 frascos, cada um contendo 250 ml de células a 0,1x106 células/ml.
      5. As células restantes (~40 ml) no Dia 8 podem ser congeladas a 1-2x106 células/ml em meio IMDM suplementado contendo 10% de DMSO e armazenadas em nitrogênio líquido.
    • Dia 10:
      1. Conte as células hematopoiéticas com Azul de Tripano para excluir células mortas e colete o número necessário de células (ou seja, ~5 ml de cultura) para testes (ver parágrafo 6). NB: A densidade celular deve ser ~1x106 células/ml.
  3. Passo 2: Dias 11-15
    Aproximadamente metade das células é coletada para uso futuro (por exemplo, extração de núcleos). As células eritroides restantes são co-cultivadas sobre células MS-5 em meio IMDM suplementado contendo EPO (Tabelas 2 e 3). As células eritroides devem ser transferidas para uma nova camada de MS-5 a cada 3-4 dias.
    • Dia 11:
      1. Conte as células eritroides com Azul de Tripano para excluir células mortas. NB: A densidade celular deve ser ~1,5x106 células/ml.
      2. Pré-aqueça 1 L de PBS 1x, 400 ml de meio IMDM suplementado e 5 L de meio IMDM suplementado contendo EPO (Tabelas 2 e 3) a 37°C.
      3. Reserve um volume de cultura equivalente a 15x108 células (por exemplo, ~4 frascos de 250 ml cada) e prossiga para o item e.
      4. As células restantes (por exemplo, 15x108) são coletadas em tubos cônicos, centrifugadas a 450 g por 10 min., re-suspensas em tampão MS30 frio (Tabela 5) contendo 0,1 mM DTT usando no máximo 108 células/ml e armazenadas a -80°C após congelamento rápido em nitrogênio líquido para uso futuro (por exemplo, extrato nuclear).
      5. Lave 50 frascos de células MS-5 confluentes com 20 ml de PBS 1x cada e imediatamente adicione 80 ml de meio IMDM suplementado fresco contendo EPO em cada frasco. NB: Devido ao grande número de frascos, processamos 4 frascos por vez. Especificamente, retiramos 4 frascos de células MS-5 confluentes da incubadora, lavamos com PBS 1x, adicionamos os 80 ml de meio e devolvemos os frascos à incubadora. Quando todos os frascos estão preparados e devolvidos à incubadora, prosseguimos para o passo f. Devido ao número de frascos a serem processados em um procedimento em larga escala, é benéfico que duas pessoas realizem essas etapas simultaneamente.
      6. Centrifugue o equivalente a 15x108 células eritroides em 4 tubos cônicos a 450 g por 10 min. e descarte o sobrenadante.
      7. Lave os 4 pellets celulares com 100 ml cada de meio IMDM suplementado.
      8. Re-suspenda cada pellet celular em 250 ml de meio IMDM suplementado contendo EPO e distribua 20 ml dessa suspensão celular para cada um dos 50 frascos contendo células MS-5 e 80 ml de meio. NB: Nesta etapa, você deve ter 50 frascos com células MS-5 confluentes contendo 100 ml de células eritroides a 0,3x106 células/ml.
      9. Expanda os 11 frascos restantes de células MS-5 diluindo-os 1:5 em frascos T-175 usando tripsina 0,05% EDTA. A concentração final de células deve ser ~0,08x106 células/ml. NB: 55 frascos de células MS-5 a ~0,08x106 células/ml devem ser preparados.
    • Dia 12:
      1. Conte as células eritroides com Azul de Tripano para excluir células mortas e colete o número necessário de células (ou seja, ~4 ml de cultura) para testes (ver parágrafo 6). NB: A densidade celular deve ser ~0,6x106 células/ml.
    • Dia 14:
      1. Conte as células eritroides com Azul de Tripano para excluir células mortas e colete o número necessário de células (ou seja, ~3 ml de cultura) para testes (ver parágrafo 6). NB: A densidade celular deve ser ~0,9x106 células/ml.
  4. Passo 3: Dias 15-18
    Algumas células são coletadas para uso futuro (por exemplo, extração de núcleos). As células eritroides restantes são co-cultivadas sobre células MS-5 em meio IMDM suplementado sem citocinas.
    • Dia 15:
      1. Conte as células eritroides com Azul de Tripano para excluir células mortas. NB: A densidade celular deve ser ~1x106 células/ml.
      2. Pré-aqueça 1 L de PBS 1x e 5 L de meio IMDM suplementado (Tabela 2) a 37°C.
      3. Reserve um volume de cultura equivalente a 10x108 células (por exemplo, ~10 frascos de 100 ml cada) e prossiga para o item e.
      4. As células restantes (por exemplo, 40x108) são coletadas e re-suspensas em tampão MS30 frio (Tabela 5) contendo 0,1 mM DTT para uso futuro (ver Passo 2: Dia 11, item d).
      5. Lave 50 frascos de células MS-5 confluentes com 20 ml de PBS 1x cada e imediatamente adicione 80 ml de meio IMDM suplementado fresco em cada frasco.
      6. Centrifugue o equivalente a 10x108 células eritroides em 4 tubos cônicos a 450 g por 10 min. e descarte o sobrenadante.
      7. Lave os 4 pellets celulares com 100 ml cada de meio IMDM suplementado.
      8. Re-suspenda cada pellet celular em 250 ml de meio IMDM suplementado e distribua 20 ml dessa suspensão celular para cada um dos 50 frascos contendo células MS-5 e 80 ml de meio. NB: Nesta etapa, você deve ter 50 frascos com células MS-5 confluentes contendo 100 ml de células eritroides a 0,2x106 células/ml.
      9. Expanda os 5 frascos restantes de células MS-5 diluindo-os 1:5 em frascos T-175 usando tripsina 0,05% EDTA. A concentração final de células deve ser ~0,08x106 células/ml. NB: 20 frascos de células MS-5 a ~0,08x106 células/ml devem ser preparados. Congele as células MS-5 restantes e armazene em nitrogênio líquido.
    • Dia 16:
      1. Conte as células eritroides com Azul de Tripano para excluir células mortas e colete o número necessário de células (ou seja, ~4 ml de cultura) para testes (ver parágrafo 6). NB: A densidade celular deve ser ~0,6x106 células/ml.
  5. Passo 4: Dias 18-26
    As células eritroides são concentradas 3-4 vezes para obter 5-7x106 células/ml no final e mantidas sobre a camada de MS-5 para permitir a maturação. 10% de SBF é adicionado ao meio IMDM suplementado para permitir melhor preservação das hemácias cultivadas (cRBCs).
    • Dia 18:
      1. Conte as células eritroides com Azul de Tripano para excluir células mortas e colete o número necessário de células (ou seja, ~2 ml de cultura) para testes (ver parágrafo 6). NB: A densidade celular deve ser ~1,7x106 células/ml.
      2. Pré-aqueça 300 ml de PBS 1x e 1,5 L de meio IMDM suplementado (Tabela 2) contendo 10% de SBF a 37°C.
      3. Lave 15 frascos de células MS-5 confluentes com 20 ml de PBS 1x cada e imediatamente adicione 80 ml de meio IMDM suplementado fresco em cada frasco.
      4. Centrifugue as células eritroides (ou seja, o equivalente a 85x108 células) a 450 g por 10 min., combine e distribua o pellet em 4 tubos cônicos.
      5. Re-suspenda cada pellet celular em 75 ml de meio IMDM suplementado contendo 10% de SBF e distribua 20 ml dessa suspensão celular para cada um dos 15 frascos contendo células MS-5 e 80 ml de meio. NB: Nesta etapa, você deve ter 15 frascos com células MS-5 confluentes contendo 100 ml de células eritroides a 6x106 células/ml.
      6. Expanda os 5 frascos restantes de células MS-5 diluindo-os 1:5 em frascos T-175 usando tripsina 0,05% EDTA. A concentração final de células deve ser ~0,08x106 células/ml. NB: 20 frascos de células MS-5 a ~0,08x106 células/ml devem ser preparados. Congele as células MS-5 restantes e armazene em nitrogênio líquido.
    • Dia 20:
      1. Conte as células eritroides com Azul de Tripano para excluir células mortas e colete o número necessário de células (ou seja, ~1,5 ml de cultura) para testes (ver parágrafo 6). NB: A densidade celular é mantida em ~1,5x106 células/ml.
    • Dia 22:
      1. Conte as células eritroides com Azul de Tripano para excluir células mortas e colete o número necessário de células (ou seja, ~1,5 ml de cultura) para testes (ver parágrafo 6). NB: A densidade celular é mantida em ~1,5x106 células/ml.
      2. Substitua o meio e transfira as células eritroides para novas camadas de células MS-5 conforme descrito no Dia 18.
    • Dia 24:
      1. Conte as células eritroides com Azul de Tripano para excluir células mortas e colete o número necessário de células (ou seja, ~1,5 ml de cultura) para testes (ver parágrafo 6). NB: A densidade celular é mantida em ~1,5x106 células/ml.
    • Dia 26:
      1. Conte as células eritroides com Azul de Tripano para excluir células mortas e colete o número necessário de células (ou seja, ~1,5 ml de cultura) para testes (ver parágrafo 6). NB: A densidade celular é mantida em ~1,5x106 células/ml.
      2. Coleta as cRBCs não aderentes, enucleadas e completamente hemoglobinizadas. NB: cRBCs maduras podem ser conservadas em meio SAGM (MacoPharma) a 4°C por até um mês.
  6. Testes e resultados representativos
    Os seguintes testes são realizados nos dias indicados para verificar a proliferação celular adequada e a diferenciação eritoide. Os resultados representativos apresentados nas figuras foram obtidos usando células CD34+ isoladas de leucoaférese.
    1. As células são contadas a cada dois dias. Veja o resultado representativo da proliferação celular na Figura 2.
    2. A coloração morfológica de May-Grünwald Giemsa é realizada a cada dois dias usando 0,05 x106 células para os Dias 0 a 8 e 0,2x106 células para os outros dias, seguindo as instruções do fabricante da coloração Giemsa (Tabela 1). Veja os resultados representativos na Figura 3.
    3. Ensaios em meio semissólido são realizados em duplicata para medir progenitores hematopoieticos a cada dois dias do Dia 0 ao Dia 12 usando 0,01x106 células por ensaio, seguindo as instruções do fabricante do meio semissólido Methocult (Tabela 1). Veja os resultados representativos na Figura 4.
    4. A análise dos seguintes marcadores celulares é realizada a cada dois dias por FACS: CD34, CD36, CD71, GPA, LDS usando 0,2 x106 células por ensaio. Veja os resultados representativos na Figura 5.
    5. A hemoglobina é medida a cada dois dias por coloração com benzidina. Veja os resultados representativos na Figura 5.
    6. A expressão gênica é estudada por RT-qPCR ou microarray após extração de RNA de 1x106 células. Veja os resultados representativos na Figura 6B.

Comentários sobre os resultados:

A Figura 1 esquematiza o protocolo para diferenciação ex vivo de células CD34+ humanas em eritrócitos maduros contendo hemoglobina. Durante a diferenciação eritoide, as células são altamente proliferativas, conforme ilustrado pela amplificação de aproximadamente 8.000 vezes mostrada na Figura 2, obtida utilizando células CD34+ isoladas de leucoaférise. Células CD34+ isoladas da medula óssea são ligeiramente menos proliferativas, com amplificação de cerca de 6.000 vezes, enquanto células CD34+ isoladas do sangue de cordão umbilical podem atingir amplificação de até 50.000 vezes. Células em estágios específicos da diferenciação exibem tamanhos e morfologias reconhecíveis, ilustrados na Figura 3. Observe o processo de enucleação que ocorre ao final da diferenciação, a partir do dia 20. No dia 26, todas as células perderam seus núcleos (Figura 3).

Os ensaios de formação de colônias mostrados na Figura 4 são utilizados para detectar progenitores hematopoiéticos precoces e tardios durante os primeiros dias de diferenciação (Dia 0 a Dia 8). Além dos progenitores eritróides (CFU-E e BFU-E), observamos que os progenitores granulocítico-macrófagos (CFU-GM) estão significativamente representados entre as células CD34+ precoces no Dia 0. À medida que a diferenciação progride, os CFU-GM diminuem significativamente e, no Dia 6, são completamente substituídos pelos progenitores eritróides BFU-E e CFU-E. É também importante observar que, do Dia 4 ao Dia 6, os progenitores eritróides precoces BFU-E são progressivamente substituídos por seus equivalentes mais diferenciados, os CFU-E. No Dia 10, as células eritróides perderam essencialmente sua capacidade de formar colônias.

Por fim, a eritropoiese é monitorada pela expressão de marcadores de superfície celular conforme mostrado na Figura 5. Observação: 1) a perda progressiva do marcador de células-tronco/progenitoras hematopoiéticas CD34; 2) a aquisição e perda progressivas do marcador progenitor CD36; 3) a aquisição e perda progressivas do marcador de progenitor eritoide e reticulócito CD71; e 4) o aumento do marcador de precursor eritoide e eritrócito GPA. Outros marcadores de diferenciação eritoide incluem a síntese de hemoglobina a partir do Dia 8 (medida pela coloração com benzidina – Figura 5) e a enucleação celular a partir do Dia 20, medida pela perda da coloração de DNA com LDS (Figura 5). Por fim, a diferenciação eritoide pode ser avaliada por RT-qPCR de marcadores moleculares, como o fator de transcrição TAL1 (Figura 6B) ou os genes da β-globina (dados não mostrados).

Normalmente, 1 ml de sangue do cordão / leucoaférese / medula óssea fornece 0,35x105 / 0,5x105 / 1,1x105 células CD34+ que, teoricamente, podem produzir 1,7x109 / 0,4x109 / 0,7x109 hemácias com taxas de proliferação respectivas de 50.000 / 8.000 / 6.000. Para obter 50x106 hemácias ao final do procedimento de diferenciação, serão necessários aproximadamente 50 ml de meio de cultura.

Parte II. Silenciamento mediado por lentivírus durante a diferenciação eritróide ex vivo

O lentivírus é uma ferramenta de escolha para transferência gênica em células primárias humanas (ver, por exemplo, Amsellem et al. 9). Os lentivírus são frequentemente utilizados para silenciar genes de interesse em células primárias por meio da entrega de shRNA direcionado (ver, por exemplo, Laurenti et al. 10). Neste protocolo, direcionamos o fator de transcrição TAL1 em células eritroides primárias humanas. Um shRNA com uma sequência aleatória que não corresponde a nenhum gene conhecido é utilizado como controle negativo. A expressão de GFP é utilizada para avaliar a eficiência de transdução.

1. Preparação de partículas de vetor lentiviral

Para obter partículas lentivirais, células de rim embrionário humano 293T são cotransfectadas com três plasmídeos: um contendo um sistema de empacotamento viral de segunda geração que codifica genes do HIV-1, exceto env, vpr, vif, vpu e nef (ou seja, psPAX2); um que codifica a envelope do vírus pseudotipado com glicoproteína G da estomatite vesicular (ou seja, pMD2G); e um vetor lentiviral que codifica o gene de interesse (ou seja, pBLOCK-it6-DEST(shTal1) que codifica shRNA para TAL1, pBLOCK-it6-DEST(shScr) que codifica shRNA aleatório ou pWPIP que codifica GFP) (Tabela 4). Partículas lentivirais são coletadas do sobrenadante do cultivo celular das células 293T transfectadas.

Para evitar infecções indesejadas de células, realizamos todos os experimentos com lentivírus (preparação dos vírus e infecção) sob uma cabine dedicada, separada de outros cultivos celulares. Além disso, os resíduos gerados por lentivírus são descartados separadamente. Os lentivírus da segunda geração descritos neste protocolo são incapazes de replicação e devem ser tratados como organismos de Nível de Biossegurança 2. Algumas instituições podem ter procedimentos específicos de segurança em relação aos lentivírus, e recomendamos que você siga as diretrizes institucionais estabelecidas.

Aqui descrevemos um protocolo que fornecerá partículas lentivirais suficientes para infectar de 1 a 2 milhões de células ertróides primárias em qualquer estágio de diferenciação. Os volumes devem ser ajustados adequadamente para ampliação ou redução da escala. Consulte as Tabelas 4 e 5 para obter informações sobre os reagentes.

  1. Transfecção de células 293T com fosfato de cálcio.
    1. Um dia antes da transfecção, semeie 13,2 x 106 células 293T em 20 ml de meio DMEM com alta concentração de glicose contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e penicilina/estreptomicina (Pen/Strep) em uma placa de cultura celular de 15 cm. Observação: Isto deve permitir que as células atinjam 70% de confluência no dia da transfecção. Os melhores resultados são obtidos utilizando células 293T de baixo número de passagens (<20).
      Opcional: as placas podem ser revestidas com colágeno tipo I ou poli-L-lisina para aumentar a aderência das células 293T.
    2. Duas horas antes da transfecção, aspire o meio das células 293T e adicione cuidadosamente 20 ml de meio fresco pré-aquecido a 37°C. Observação: Geralmente iniciamos a transfecção ao final do dia.
    3. Misture os seguintes reagentes em um tubo de 5 ml:
      • 44,8 μg de vetor de expressão para o seu gene de interesse (por exemplo, shRNA ou GFP — ver Tabela 4)
      • 13,35 μg de vetor do envelope pMD2.G.
      • 33,48 μg de vetor de empacotamento psPAX2.
      • Adicione água estéril suficiente para completar o volume até 1,116 ml.
    4. Adicione água estéril suficiente para completar o volume até 1,116 ml.
    5. Adicione 109,8 μl de CaCl2 2,5 M e vortexie para homogeneizar.
    6. Em um tubo cônico de 50 ml, adicione 1,116 ml de tampão 2xHBS (Tabela 5).
    7. Sob agitação constante com vortex, adicione a mistura de DNA gota a gota ao tampão 2xHBS.
    8. Deixe o precipitado formar em temperatura ambiente (RT) por 20 min (não mais que 30 min).
    9. Adicione a solução de 2,3 ml gota a gota à placa contendo as células 293T, agite suavemente e transfira as células para uma incubadora a 37°C por 12-14 horas.
    10. No início da manhã seguinte, aspire o meio e substitua por 20 ml de meio fresco pré-aquecido a 37°C.
  2. Coleta e concentração do lentivírus
    1. Quarenta e oito horas após a transfecção, colete 20 ml do meio contendo o lentivírus e coloque em um tubo cônico de 50 ml.
    2. Adicione 20 ml de meio pré-aquecido a 37°C às células 293T e retorne-as à incubadora.
    3. Centrifugue o sobrenadante viral a 450 g por 10 min para remover eventuais detritos celulares e transfira para um novo tubo de 50 ml. Alternativamente, o sobrenadante pode ser filtrado através de um filtro de 0,45 μm. Armazene o sobrenadante clarificado a 4°C.
    4. Vinte e quatro horas depois, colete os 20 ml restantes do meio. Observação: Observamos que os títulos virais são aproximadamente equivalentes em ambas as coletas, ou seja, 1x 106 UT/ml.
    5. Para concentrar os vírus, os sobrenadantes virais são distribuídos em tubos Beckman OptiSeal (utilize 32,4 ml de sobrenadante por tubo) e centrifugados a 100.000 g por 1,5 h a 4°C, utilizando rotor de balancim. Observação: Métodos alternativos para concentrar o sobrenadante viral incluem centrifugação a 47.000 g por 2 h ou a 3.000 g por 8 h. Não congele o vírus antes da concentração. O congelamento causará precipitação de proteínas, dificultando a ressuspensão do vírus.
    6. Imediatamente após a ultracentrifugação, aspire lentamente o sobrenadante utilizando uma pipeta plástica de 10 ml e descarte-o. Observação: Tenha cuidado para não perturbar o pellet, que pode se desprender facilmente do tubo. Após descartar os primeiros 5 ml do sobrenadante, geralmente cortamos a parte superior do tubo de ultracentrifugação para facilitar a remoção do maior volume possível de sobrenadante, ou seja, deixe cerca de 100-200 μl de meio no fundo do tubo.
    7. Adicione 100 μl de PBS 1x, deixe o pellet dissolver em temperatura ambiente por 30 min e ressuspenda pipetando para cima e para baixo 15-20 vezes. Observação: Normalmente, obtemos cerca de 200-300 μl de vírus concentrado.
    8. O preparo concentrado de lentivírus é titulado em células NIH3T3 utilizando um protocolo da Invitrogen (Sistema de Expressão Block-it de RNAi por Lentivírus). Observação: Normalmente obtemos títulos virais entre 2 e 10x108 unidades transdutoras (UT)/ml.
    9. O vírus pode agora ser usado para infecção (ver parágrafo 2) ou fracionado e armazenado a -80°C por até 6 meses. Observação: Não submeta as suspensões virais a mais de um ciclo de congelamento-descongelamento. Os vírus são estáveis por 4-5 h a 37°C, 2-3 dias em temperatura ambiente ou uma semana a 4°C.

2. Infecção lentiviral de células eritroides primárias para entrega gênica

  1. Infecção
    Células eritroides nucleadas podem ser eficientemente infectadas em qualquer estágio de diferenciação, desde que uma alta MOI (multiplicidade de infecção) de 50-100 seja utilizada. Aqui descrevemos um experimento típico no qual lentivírus expressando um shRNA direcionado ao TAL1 ou um shRNA controle aleatório (scramble) são usados para infectar células eritroides nos dias 8 e 9 de diferenciação, utilizando uma MOI de 50 TU/célula. O RNA é extraído a cada 24 horas para verificar o nível de silenciamento do TAL1 por RT-qPCR. A expressão de GFP é medida em paralelo por citometria de fluxo (FACS) para avaliar a eficiência de infecção (ver resultados representativos na Figura 6).
    • Dia 0:
      1. Prepare três tubos cónicos de 15 ml contendo 1x106 células eritroides cada (ou seja, um tubo para silenciamento do TAL1, um tubo para controle negativo aleatório e um tubo para controle de expressão de GFP).
      2. Lave as células com 5 ml de meio IMDM suplementado contendo SCF e EPO (ver Parte I), centrifugue a 200 g durante 5 min. e remova o máximo possível do sobrenadante.
      3. Adicione polibreno (Tabela 4) numa concentração final de 40 μg/ml à solução de vírus concentrado.
      4. Adicione 100 μl de vírus concentrado (ou seja, 5x107 TU) contendo polibreno a cada tubo de células eritroides.
      5. Incube por 1 h no incubador a 37°C e misture batendo levemente com o dedo a cada 10 min. N.B. a infecção deve ser realizada com volumes mínimos de meio para permitir a máxima adsorção do lentivírus nas células. Além disso, a mistura a cada 10 min. garante uma distribuição uniforme do vírus entre as células.
      6. Adicione 900 μl de meio IMDM suplementado contendo SCF e EPO (Tabelas 2 e 3) a cada tubo.
      7. Transfira cada amostra para uma placa de 6 poços e coloque no incubador a 37°C por 24 h.
    • Dia 1: Recolha as células em tubos separados de 15 ml, centrifugue a 200 g por 5 min., remova o sobrenadante e repita a infecção (passos b a g acima).
    • Dia 2: Lave as células e re-suspenda-as a 0,2x106 células/ml em meio IMDM suplementado contendo SCF e EPO e prossiga como na Parte I.
  2. Resultados representativos
    A Figura 6A ilustra o protocolo de infecção de células eritroides primárias com lentivírus seguido de extração de RNA. Em um experimento, infectamos células eritroides com lentivírus produzindo um shRNA direcionado ao fator de transcrição TAL1 ou um controle aleatório 11. A Figura 6B mostra que conseguimos silenciar 75% dos transcritos do TAL1 em células eritroides primárias. Observe também o aumento no nível de transcritos do TAL1 do dia 9 ao dia 12 no controle aleatório, destacando a importância desse fator de transcrição durante a diferenciação eritoide. Em outro experimento, infectamos células eritroides com lentivírus expressando a proteína GFP. A Figura 6C mostra que, três dias após a infecção, a maioria das células eritroides (87%) está expressando GFP, conforme medido por fluorescência ao microscópio e por FACS. Isso indica uma alta eficiência de infecção em células eritroides primárias. Anteriormente, infectamos células CD34+ no dia 0 com eficiência semelhante (dados não mostrados). O parâmetro mais importante para uma transdução eficiente de células primárias é o uso de uma alta MOI (ou seja, lentivírus concentrados). Se uma MOI baixa for utilizada (ou seja, vírus não concentrado), a eficiência de transdução diminuirá.

3. Resultados Representativos

Diagrama de isolamento positivo de CSH CD34+; separação imunomagnética, diferenciação eritróide livre de soro.
Figura 1. Esquema do protocolo para o isolamento e diferenciação eritróide ex vivo de células-tronco/progenitoras hematopoiéticas primárias humanas. (Passo 1) Células CD34+ (pureza de 95 ± 3%) são isoladas de sangue de cordão umbilical, medula óssea ou sangue periférico humano mobilizado com G-CSF (leucoaférise) utilizando seleção imunomagnética positiva. (Passo 2) Células CD34+ são cultivadas em cultura líquida de acordo com o protocolo em quatro etapas indicado.

Gráfico de amplificação celular; escala logarítmica; dias de cultivo versus análise da tendência de crescimento celular.
Figura 2. Amplificação celular durante o protocolo de diferenciação eritróide ex vivo. Os resultados estão em escala logarítmica. Resultados representativos obtidos com células CD34+ isoladas de leucoaférise.

Quadro das fases da eritropoiese, imagens microscópicas acompanhando o desenvolvimento dos eritrócitos ao longo de 26 dias.
Figura 3. Análise da morfologia celular durante a diferenciação eritoide ex vivo. As células são coradas com o reagente de May-Grünwald-Giemsa nos pontos temporais indicados durante a diferenciação (aumento × 40). HSC: células-tronco/progenitoras hematopoiéticas; BFU-E: unidades formadoras de surto –eritroide; CFU-E: unidades formadoras de colônia –eritroide; Pro EB: proeritroblastos; Baso EB: eritroblastos basófilos; Poly EB: eritroblastos policromatófilos; Ortho EB: eritroblastos ortocromáticos; RET: reticulócitos; RBC: eritrócitos.

Gráfico do ensaio semissólido; crescimento de progenitores CFU-GM, BFU-E, CFU-E; dias de cultura celular; comparação de imagens.
Figura 4. Ensaios de células formadoras de colônias (CFC) para detectar e quantificar progenitores hematopoéticos. Nos momentos indicados, 104 células foram semeadas em um meio semissólido de metilcelulose na presença de citocinas humanas recombinantes: rh SCF, rh GM-CSF, rh G-CSF, rh Il-3, rh EPO para promover o crescimento ideal de progenitores eritroides (BFU-E e CFU-E) e progenitores de granulócitos e macrófagos (CFU-GM). BFU: unidades formadoras de explosão; CFU: unidades formadoras de colônia. Também são mostradas imagens típicas de BFU-E e CFU-E. Observe a coloração marrom-avermelhada devido à hemoglobinização de BFU-E e CFU-E.

Gráficos de diferenciação hematopoética mostrando marcadores celulares CD34, CD36, CD71, GPA, Benzidina, LDS ao longo do tempo.
Figura 5. Cinética dos marcadores hematopoéticos/eritroides durante a diferenciação eritoide ex vivo. Nos pontos de tempo indicados, 2x105 células foram colhidas e analisadas quanto à expressão dos marcadores indicados por citometria de fluxo (CD34, CD36, CD71, GPA e LDS) ou por microscopia (Benzidina). As barras representam as porcentagens de células positivas. CD34: glicoproteína transmembranar, presente em células-tronco/progenitoras hematopoéticas humanas; CD36: receptor da trombospondina, presente em células progenitoras; CD71: receptor da transferrina, presente em progenitores eritroides e reticulócitos; GPA: glicoforina A, presente em precursores eritroides e eritrócitos; Benzidina: corante de hemoglobina; LDS: corante laser estirílico, corante de DNA.

Linha do tempo da infecção por shRNA de lentivírus, gráfico de barras da expressão de mRNA de TAL1, microscopia de GFP, citometria de fluxo.
Figura 6. Transferência gênica mediada por lentivírus em proeritroblastos primários humanos. (A) Linha do tempo para indução do silenciamento gênico de TAL1 (KD) em proeritroblastos primários utilizando o sistema de entrega gênica por lentivírus. (B) O silenciamento de TAL1 foi mediado por shRNA anti-Tal1 entregue por lentivírus (TAL1 KD) ou por um shRNA controle aleatório (Scr). A cinética dos níveis de transcritos de mRNA de TAL1 foi medida por RT-qPCR. Os transcritos de TAL1 são expressos em relação ao RNA 18S. (C) A GFP entregue por lentivírus foi testada por microscopia (painel esquerdo) ou por FACS (painel direito). 87% das células foram positivas para GFP.

4. Materiais

ReagenteFornecedorNúmero de catálogo
RPMI 1640 SigmaR8758
Colagenase BRoche Applied Science11088807001
DNase ISigmaD5025-15KU
Filtros pré-separação (malha de náilon 30μm)Miltenyi Biotec Inc130-041-407
Ficoll-paque PLUS GE Healthcare Bio-Sciences17-1440-03
Tampão de lise de eritrócitos EasySep 10xStemCell Technologies20120
Kit de Microesferas CD34Miltenyi Biotec Inc130-046-703
Colunas LS Mini-MacsMiltenyi Biotec Inc130-042-401
Tampão de operação autoMACS – Tampão de separação MACSMiltenyi Biotec Inc130-091-221
Separador MiniMACSMiltenyi Biotec Inc130-042-102
Células estromais da medula óssea de camundongo MS-5 (testadas regularmente para contaminação por micoplasma)DSMZACC 441
Solução de Azul de Tripano (0,4%)SigmaT8154
MEM Alpha+GlutaMAX Gibco Invitrogen 32571
Tripsina 0,05%/EDTAThermoScientific J101521
May Grunwald Giemsa Biostain Ready Reagents Ltd RRSP54
Ensaios Methocult de formação de colônias (CFC) para células humanas StemCell Technologies 04044

Tabela 1.

ComponenteSolução estoqueVolume 600 ml
IMDMSigma I3390443,4 ml
Penicilina/Estreptomicina 1% (vol/vol)Gibco 103786 ml
L-glutamina 4x10-3M200 mM (Gibco 25030)12 ml
Inositol 40 μg/ml4 mg/ml (Sigma I5125)
preparação: Dissolver 28 mg de pó em 7 ml de IMDM e filtrar para esterilizar — estável por 1 semana a 4 °C.		6 ml
Ácido fólico 10 μg/ml1 mg/ml (Sigma F7876)
preparação: Dissolver 7 mg de pó em 7 ml de IMDM pré-aquecido e filtrar para esterilizar — estável por 1 semana a 4 °C. Pré-aquecer antes do uso.		6 ml
Monotiolglicerol 1,6x10-4M0,16 M (Sigma M6145)
preparação: Dissolver 10 μl da solução estoque 11,56 M em 712 μl de IMDM e filtrar para esterilizar — estável por 1 semana a 4 °C.		0,6 ml
Nitrato ferroso 90 ng/ml18 μg/ml (Sigma 8508)
preparação: Dissolver 1,8 mg em 1 ml de água destilada. Retirar 0,1 ml, adicionar 9,9 ml de IMDM e filtrar para esterilizar — estável por 1 semana a 4 °C.		3 ml
Sulfato ferroso 900 ng/ml180 μg/ml (Sigma F8633)
preparação: Dissolver 18 mg em 1 ml de água destilada. Retirar 0,1 ml, adicionar 9,9 ml de IMDM e filtrar para esterilizar — estável por 1 semana a 4 °C.		3 ml
Albumina sérica bovina-Insulina-Transferrina (BIT)
20% (vol/vol)		StemCell Technologies 9500120 ml

Tabela 2.

ComponenteSolução estoqueVolume a adicionar a 100 ml de IMDM suplementado (Tabela 2)
Hidrocortisona (HC) 10-6 M10-4 M (Sigma H2270)
preparação: Dissolver 5 mg de pó em 1,03 ml de IMDM. Retirar 0,1 ml, adicionar 9,9 ml de IMDM e esterilizar por filtração. Estável por 1 semana a 4°C.		1 ml
Fator de Células-Tronco (SCF) 100 ng/ml100 μg/ml (Cedarlane 4327-50)
preparação: Dissolver 50 μg de pó em 500 μl de PBS + 0,1% BSA e esterilizar por filtração. Fazer alíquotas de 100 μl e armazenar a -20°C.		100 μl
Eritropoetina (EPO) 3 UI/mlEquivalente a 100 μg/ml de 12.000 UI/ml (Feldan FB03-10-290)
preparação: Dissolver 50 μg de pó em 500 ml de PBS + 0,1% BSA e esterilizar por filtração. Fazer alíquotas de 25 ml e armazenar a -20°C.		25 μl
Interleucina 3 (IL3) 5 ng/ml100 μg/ml (Feldan FB03-10-330)
preparação: Dissolver 10 μg de pó em 100 μl de PBS + 0,1% BSA e esterilizar por filtração. Fazer alíquotas de 5 ml e armazenar a -20°C.		5 μl

Tabela 3.

ReagenteOrigemReferência
Células 293T
(testar regularmente para contaminação por micoplasma)		ATCCCRL-11268
DMEM/Glicose AltaThermoScientificSH30243.01
Brometo de hexadimetrina (Polybrene)SigmaH9268-5G
Tubos de ultracentrifugação OptiSealBeckman Coulter361625
Plasmídeo psPAX2Addgene (laboratório D. Trono)12260
Plasmídeo pMD2.GAddgene (laboratório D. Trono)12259
Plasmídeo pBLOCK-it6-DEST (shTal1)Sequência de shRNA anti-Tal1 clonada no plasmídeo pBLOCK-it6-DEST da InvitrogenPalii et al. EMBO J.
Plasmídeo pBLOCK-it6-DEST (shScr)Sequência de shRNA aleatória clonada no plasmídeo pBLOCK-it6-DEST da InvitrogenPalii et al. EMBO J.
Plasmídeo pWPIAddgene (laboratório D. Trono)12254

Tabela 4.

TampãoPreparaçãoConcentração final
2xHBS
  • 1,6 g de NaCl
  • 1,3 g HEPES
  • 0,04 g de Na2HPO4(7H2O)
  • Adicione água Milli-Q.
  • Ajuste o pH para exatamente 7,11–7,13 adicionando solução de NaOH e complete com água milli-Q até 100 ml.
  • Ajuste o pH para 7,11-7,13.
  • Filtrar para esterilizar, fazer alíquotas de 10 ml e armazenar a -20 °C
  • 280 mM
  • 100 mM
  • 1,5 mM
CaCl2
  • 2,77 g de CaCl anidro2
  • Dissolver em 10 ml de água Milli-Q.
  • Filtrar para esterilizar, fazer alíquotas de 1 ml e armazenar a -20 °C
  • 2,5 M
MS30
  • 25 ml de Tris [2 M] pH 8,0
  • 5 ml de EDTA [0,5 M]
  • 300 ml de Glicerol
  • 50 mM
  • 2,5 mM
  • 30% (v/v)

Tabela 5.

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Discussão

Um certo número de métodos têm sido utilizados anteriormente para diferenciar células eritróides em cultura, com graus variáveis ​​de sucesso. Por exemplo, alguns protocolos, sem co-cultura em MS-5 permite a expansão de células eritróides, mas não são eficientes na produção de plena maturidade enucleados glóbulos vermelhos 12-17. Enquanto outros métodos permitem enucleação eficiente, é à custa de proliferação 18,19. O método que usamos aqui, inicialmente desenvolvido pelo laboratório Douay 6,<...

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Agradecemos a L. Douay e MC Giarratana (Université Paris VI, França) para aconselhamento sobre a diferenciação eritróide ex vivo, D. Allan H. e Atkins (Ohri, Canadá) para fornecer amostras de sangue (obtida no âmbito do Hospital Ottawa Conselho de Ética em Pesquisa # 2007804-01H), D. Trono (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne) para fornecer os vetores lentiviral e FJ Dilworth (Ohri, Canadá) pela leitura crítica do manuscrito. Este projeto foi financiado por uma doação CIHR (MOP-82813) para MBCGP é um receptor de uma Bolsa de Investigação do Fundo de Treinamento Ontario Computacional Regulomics Pós-Doutorado. MB detém a Cátedra de Pesquisa do Canadá na regulação da expressão gênica.

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Referências

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  2. Kim, S. I., Bresnick, E. H. Transcriptional control of erythropoiesis: emerging mechanisms and principles. Oncogene. 26, (2007).
  3. Friend, C., Patuleia, M. C., De Harven, E. Erythrocytic maturation in vitro of murine (Friend) virus-induced leukemic cells. Natl Cancer Inst Monogr. 22, 505-522 (1966).
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