Lentivirus mediada Durante Knockdown Ex Vivo Eritropoese de Células-Tronco Hematopoéticas

Resumo

Um Ex vivo Protocolo para gerar humano maduro glóbulos vermelhos a partir de tronco hematopoiéticas / progenitores é descrito. Além disso, descrevemos um método de entrega-lentiviral eficiente para knockdown do TAL1 fator de transcrição em células primárias eritróide. A eficiência do lentivírus de entrega gene mediada é demonstrada usando vírus GFP expressar.

Resumo

Eritropoiese é um sistema modelo comumente usado para estudar a diferenciação celular. Durante a eritropoiese, pluripotentes humano adulto células-tronco hematopoéticas (HSCs) diferenciar em progenitores oligopotent, precursores e glóbulos vermelhos maduros ^1. Este processo é regulado por uma grande parte ao nível da expressão gênica, em que fatores de transcrição específicos ativar genes de linhagem específica, enquanto concomitantemente reprimindo genes que são específicos para outros tipos de células ^2. Estudos sobre fatores de transcrição que regulam a eritropoiese são frequentemente realizadas usando linhas de células humanas e camundongos, que representam, até certo ponto, as células eritróides, em determinadas fases de diferenciação ^3-5. Linhagens de células transformadas no entanto só pode imitar parcialmente células eritróides e mais importante é que eles não permitem que se compreensível estudar as mudanças dinâmicas que ocorrem como células progridem por muitos estágios para o seu destino eritróide final. Portanto, um desafio atual continua a ser o desenvolvimento de um protocolo para obter populações relativamente homogêneas de HSCs primária e células eritróides em vários estágios de diferenciação em quantidades que são suficientes para executar genômica e proteômica experimentos.

Aqui nós descrevemos um ex vivo protocolo de cultura de células para induzir a diferenciação eritróide de humano-tronco hematopoiéticas / progenitoras que foram isolados a partir de qualquer sangue do cordão umbilical, na medula óssea ou sangue periférico de adultos mobilizados com G-CSF (leucaférese). Este sistema de cultivo, inicialmente desenvolvido pelo laboratório Douay ^6, usa citocinas e co-cultura em células mesenquimais para imitar o microambiente da medula óssea. Usando este protocolo diferenciação ex vivo, observamos uma ampliação forte de progenitores eritróides, uma indução de diferenciação exclusivamente para a linhagem eritróide e uma maturação completa para o estágio de enucleados células vermelhas do sangue. Assim, este sistema oferece uma oportunidade para estudar o mecanismo molecular de regulação da transcrição como células-tronco hematopoiéticas progresso ao longo da linhagem eritróide.

Estudando eritropoiese no nível de transcrição também requer a capacidade de sobre-expressar ou knockdown fatores específicos em células primárias eritróide. Para este fim, usamos um lentivírus mediada sistema de entrega de gene que permite a infecção eficiente de ambos dividindo e não dividir células ^7. Aqui nós mostramos que somos capazes de forma eficiente o knockdown TAL1 fator de transcrição em células primárias de eritróide humana. Além disso, a expressão GFP demonstra uma eficiência de infecção lentiviral cerca de 90%. Assim, o nosso protocolo prevê um sistema altamente útil para a caracterização da rede de regulação de fatores de transcrição que eritropoiese controle.

Protocolo

Parte I. Eritropoese ex vivo de células-tronco/progenitoras hematopoiéticas humanas

1. Isolamento de células-tronco/progenitoras hematopoéticas humanas CD34⁺

A população de células CD34⁺ humanas, que contém uma mistura de células-tronco hematopoiéticas (CTHs) e progenitores precoces ⁸, é obtida a partir de sangue de cordão umbilical, sangue periférico mobilizado com G-CSF (leucoaférise) ou medula óssea (Figura 1 - Etapa 1). Se utilizar sangue de cordão ou sangue periférico, vá diretamente para a etapa 1.2. Se utilizar medula óssea, inicie na etapa 1.1. Para reagentes e equipa....

Discussão

Um certo número de métodos têm sido utilizados anteriormente para diferenciar células eritróides em cultura, com graus variáveis ​​de sucesso. Por exemplo, alguns protocolos, sem co-cultura em MS-5 permite a expansão de células eritróides, mas não são eficientes na produção de plena maturidade enucleados glóbulos vermelhos ^12-17. Enquanto outros métodos permitem enucleação eficiente, é à custa de proliferação ^18,19. O método que usamos aqui, inicialmente desenvolvido pelo laboratório Douay ^6,<.......