Transdução de células humanas com Polymer-complexado Lentivirus Ecotropic para reforço de Biossegurança

Resumo

Lentivírus são um valioso instrumento de pesquisa para explorar a função do gene, no entanto, os pesquisadores podem querer evitar a produção de codificação lentivírus pantropic conhecida ou suspeita de oncogenes. Como alternativa, apresentamos um protocolo mais seguro para o uso de lentivírus ecotropic em células humanas modificadas para expressar o receptor mSlc7a1 ecotropic.

Resumo

Caule e tumor estudos de biologia celular muitas vezes exigem transdução viral das células humanas com oncogenes conhecidos ou suspeitos, levantando questões importantes de segurança para o pessoal de laboratório. Lentivírus Pantropic, como o comumente usado VSV-G pseudotype, são uma ferramenta valiosa para estudar a função do gene porque pode converter muitos tipos de células, incluindo células não-divisão. No entanto, os pesquisadores podem querer evitar a produção de vírus e centrifugação pantropic codificação oncogenes devido ao maior nível de biossegurança requisitos manuseio e segurança. Vários oncogenes potentes, incluindo c-Myc e SV40 antígeno T grande, são conhecidos por aumentar a produção de células-tronco pluripotentes induzidas (IPSC). Todos os outros conhecidos iPSC-induzir mudanças genéticas (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28, p53 e perda da função) também têm ligações ao câncer, tornando-os relativos à segurança relativamente alta também.

Embora estes vírus relacionados ao câncer são úteis no estudo de reprogramação celular e pluripotência, eles devem ser usados ​​com segurança. Para tratar dessas questões de biossegurança, demonstramos um método para a transdução de células humanas com lentivírus ecotropic, com ênfase adicional sobre o custo reduzido e fácil manuseamento. Nós produzimos lentivírus ecotropic com título suficientemente elevado para transduzir superior a 90% do receptor-expressando células humanas expostas ao vírus, validando a eficácia desta abordagem.

Lentivírus é frequentemente concentrada por ultracentrifugação, no entanto, este processo leva várias horas e pode produzir aerossóis infecciosos para humanos pesquisadores biomédicos. Como alternativa, as partículas virais podem ser mais segura sedimentada em células por complexação com sulfato de condroitina e polibrene (CS / PB). Esta técnica aumenta a título funcional viral até 3 vezes nas células que expressam o receptor de forma estável retrovirus murino, com o tempo e custo insignificante acrescentou. Transdução de fibroblastos dérmicos humanos (HDFS) é maximamente melhorada usando CS / PB concentrações aproximadamente 4 vezes menor que o valor ideal relatado anteriormente para linhas celulares de cancro, sugerindo que a concentração de polímero deve ser ajustada para o tipo de célula-alvo de interesse. Nós, portanto, descrever o uso de brometo de tetrazólio-metiltiazolildifenil (MTT) para ensaio de toxicidade do polímero em um novo tipo de célula. Observamos viabilidade equivalente a HDFS após a transdução viral usando complexação de polímeros ou a dose padrão de polibrene (PB, 6 mg / ml), indicando toxicidade aguda mínima.

Neste protocolo, descrevemos o uso de lentivírus ecotropic para superexpressão de oncogenes em células humanas, reduzindo os riscos de biossegurança e aumentar a taxa de transdução. Nós também demonstrar o uso de complexação de polímeros para aumentar a transdução, evitando aerossol de formação de centrifugação das partículas virais.

Protocolo

1. Produção, coleta e congelamento de lentivírus

1. Consulte o responsável pela segurança institucional antes de iniciar este protocolo e siga as diretrizes de segurança recomendadas.
2. Dia 1. Inicie com células 293T saudáveis e em rápido crescimento para produzir o vírus. Plaque as células a 5 x 10⁶ células por placa de 10 cm. Utilize meio para 293T sem antibiótico (DMEM de alta glicose com 10% de FBS e 4 mM de L-glutamina) para a produção do vírus.
3. Dia 2. No final da tarde, transfete as células 293T conforme a seguir (os valores indicados referem-se a uma placa de 10 cm). Deixe todos os reagentes atingirem a temperatura ambiente. Pipete 375 μl de OptiMEM em um tubo de microcentrífuga e adicione 25 μl de Fugene HD. Evite que o Fugene não diluído entre em contato com a superfície do tubo.
4. Em um tubo de microcentrífuga, misture:
   • 5 μg do plasmídeo de transferência (Slc7a1, vetor alvo ou vetor controle fluorescente)
   • 3,75 μg do plasmídeo de empacotamento (pCMV-dR8.91 ou psPax2)
   • 1,25 μg do plasmídeo de envelope (pMD2.G para pantrópico, pHCMV-EcoEnv para eutrópico)
   • OptiMEM sem soro até completar 100 μl
5. Combine os dois tubos e incube a mistura por 20-30 minutos à temperatura ambiente.
6. Troque o meio das células 293T por 10 ml de meio fresco sem antibiótico. Adicione a mistura de Fugene/plasmídeo gota a gota na placa e incube durante a noite a 37°C, 5% CO₂.
7. Dia 3. Troque o meio das células 293T por 10 ml de meio fresco sem antibiótico. Seja cuidadoso, pois as células 293T aderem-se fracamente e podem destacar-se se o meio for pipetado com muita força sobre a monocamada. Incube por dois dias em incubadora umidificada para produção do vírus.
8. Dia 5. Recolha o vírus e filtre com um filtro de baixa ligação a proteínas de 0,45 mm. Use imediatamente ou distribua em alíquotas de uso único e congele a -80°C. O vírus pantrópico e eutrópico congelado deve ter seu título reavaliado após seis meses e um mês de armazenamento, respectivamente.
9. Titule o vírus conforme a seguir, utilizando células relativamente suscetíveis à transdução. Transduza as células com o vírus controle fluorescente durante a noite, usando diluições seriadas (por exemplo, 1:10, 1:100, 1:1000) em meio fresco com 6 μg/ml de PB. Troque para meio fresco no dia seguinte. Permita que as células passem dois dias após a transdução para começar a expressar a proteína fluorescente e, em seguida, determine a fração de células transduzidas por FACS. Calcule o título em unidades transformantes (TU) por ml, com base nas diluições que resultam em < 15% de transdução, a fim de minimizar eventos de múltiplas transduções.
   

2. Transdução de células-alvo humanas com o receptor de retrovírus murino Slc7a1

1. Selecione uma multiplicidade de infecção (MOI) = 2 para garantir que a maioria das células será transduzida. Para células-alvo resistentes à transdução, como HDFs, será necessário um MOI mais alto; diluímos o sobrenadante viral apenas na proporção de 1:2 para alcançar a transdução da maioria das células.
2. Transduza as células-alvo durante a noite com sobrenadante viral diluído em meio de cultura fresco contendo 6 μg/ml de PB, o que aumenta a transdução ao potencializar a interação eletrostática entre o vírus e a célula-alvo.¹ Idealmente, deve-se usar um volume mínimo de vírus, como 1 ml para uma placa de 35 mm, pois a difusão é um fator limitante na eficiência de transdução.
3. Cultive as células por pelo menos 48 horas após a remoção do vírus antes de transduzi-las com vírus ecótrofico, a fim de garantir expressão suficiente do receptor Slc7a1.
4. (Opcional) É possível usar blasticidina para selecionar células transduzidas de forma estável que expressam Slc7a1, se desejado. Deve-se gerar previamente uma curva de morte com blasticidina para determinar a menor concentração eficaz, geralmente entre 2 – 10 μg/ml, que elimina todas as células-alvo não transduzidas em 7 dias. Cerca de 2 dias após a remoção do vírus Slc7a1, mude as células transduzidas para meio contendo blasticidina. Cultive as células em meio com blasticidina por 7 dias, momento em que todas as células remanescentes expressarão de forma estável o receptor de retrovírus, podendo então ser transduzidas com vírus ecótrofico, bem como armazenadas para uso futuro como uma linhagem estável expressora de Slc7a1.

3. Titulação de complexo polimérico para determinar toxicidade

1. Dia 1. Plaque as células a 5000 células/poço em uma placa de 96 poços, garantindo pelo menos três poços replicados para cada grupo experimental. Inclua células não transduzidas em meio completo para fornecer um valor de referência para células saudáveis, bem como amostras compostas por células em meio sem soro para induzir a parada de crescimento como controle. Em paralelo, plaque as células em um formato apropriado (como uma placa de 24 poços) para análise microscópica ou por FACS da eficiência de transdução em cada condição experimental.
2. Dia 2. Transduza as células nas placas preparadas para as análises de MTT e FACS com vírus que codifica GFP, com uma MOI de 0,5 para transduzir cerca de 40% das células-alvo. Teste diferentes concentrações de CS/PB (por exemplo, 50, 100, 200, 400, 600 e 800 mg/ml de cada componente), bem como 6 μg/ml de PB, para determinar as quantidades ideais. Prepare os complexos poliméricos conforme descrito na Parte 4, abaixo.
3. Dia 3. Remova o meio contendo o vírus e substitua por meio fresco. Retorne as placas para uma incubadora umidificada.
4. Dia 5. Analise a placa de FACS para determinar a eficiência de transdução com cada concentração de polímero.
5. Dia 6. Remova o meio de todos os poços da placa de MTT e substitua por 100 μl de solução de MTT (1 mg/ml de MTT em meio completo). Incube por três horas em uma incubadora umidificada para permitir a redução do MTT nas mitocôndrias das células metabolicamente ativas.
6. Remova a solução de MTT e substitua por 200 ml de solvente de MTT (0,1 N HCl, 0,1% Igepal CA-630 em isopropanol).
7. Incube por duas horas à temperatura ambiente ou até que todo o precipitado roxo de formazano de MTT esteja completamente dissolvido. Leia a absorbância em um leitor de microplacas a 570 nm, subtraindo a leitura de fundo a 690 nm.
8. Selecione a concentração ideal de polímero que produza o máximo aumento na transdução, conforme determinado por FACS, com efeito mínimo sobre a atividade metabólica, conforme determinado pelo ensaio de MTT. Para HDFs, selecionamos 100 μg/ml de CS/PB com base nos dados apresentados nos Resultados Representativos, abaixo.

4. Transdução ecótrofica com complexação por polímero

1. Prepare soluções estoque de PB e sulfato de condroitina, filtradas estéreis, a 20 mg/ml em água. Aliquote e armazene a -20°C.
2. Pipete o sobrenadante viral em um tubo de microcentrifugação e dilua até a concentração final desejada (por exemplo, MOI de 2) com meio de cultura fresco. Adicione volumes iguais de PB e sulfato de condroitina (concentrações determinadas no passo 3 acima) sucessivamente, agitando levemente o tubo para misturar após cada adição. A mistura viral ficará imediatamente turva à medida que os precipitados se formam. Incube a mistura viral à temperatura ambiente por 5 minutos para permitir a formação do complexo.
3. Remova o meio das células-alvo que expressam o receptor, substitua pela mistura viral e incube durante a noite a 37°C, 5% CO2. Após a remoção da mistura viral, lave a superfície das células duas vezes com PBS para auxiliar na remoção dos complexos virais. A remoção completa não é necessária; não observamos efeitos adversos na saúde celular provocados por complexos poliméricos residuais.

5. Verificando a especificidade da transdução ecótropica

1. Ao produzir o vírus ecótrofico pela primeira vez, é prudente, do ponto de vista de segurança, verificar se o vírus é incapaz de transduzir células humanas não modificadas. Transduza células humanas com lentivírus ecótrofico em concentração relativamente alta (apenas uma diluição de 1 a 2 vezes do sobrenadante viral em meio fresco) durante a noite com 6 μg/ml de PB ou concentração otimizada de CS/PB.
2. Remova o meio contendo o vírus e substitua por meio fresco. Após incubar as células por 2 dias, valide a expressão do transgene por meio de FACS utilizando vetores fluorescentes e/ou por RT-PCR com primers específicos para o transgene.

6. Resultados representativos:

A Fig. 1A mostra o processo de produção de lentivírus, e a Fig. 1B mostra a transdução de células humanas com lentivírus ecotrópico, incluindo a pré-transdução com o receptor de retrovírus murino Slc7a1. Para titulação do vírus, utilizamos uma linhagem celular de rabdomiossarcoma humano estavelmente transduzida com Slc7a1 (Slc-hRMS). Ao utilizar vetores-controle fluorescentes para monitorar a eficiência de transdução, alcançamos rotineiramente eficiência de transdução > 90% de Slc-hRMS com vírus ecotrópico, conforme mostrado nas Fig. 2A e 2B. As taxas de transdução de HDFs são geralmente menores porque as células não foram selecionadas com blasticidina para expressão do receptor (Fig. 2C). Os títulos de lentivírus ecotrópico são geralmente de 10-20% dos do vírus pseudotipado com VSV quando medidos em Slc-hRMS (Fig. 2D).

Um ciclo de congelamento-descongelamento reduz o título do vírus ecotrópico em 16 - 3%, equivalente à perda de título durante um único ciclo de congelamento-descongelamento do vírus pseudotipado com VSV (p > 0,05). Contrariamente a relatos anteriores,² não observamos nenhum efeito positivo no título viral causado pelo congelamento rápido em gelo seco. Pelo contrário, alcançamos títulos pós-descongelamento mais altos para qualquer pseudotipo simplesmente colocando os tubos com vírus diretamente no congelador a -80°C (dados não mostrados).

O ensaio de viabilidade com MTT permite a detecção sensível de parada de crescimento em células-alvo. A transdução com vírus mais concentrações de CS/PB até 800 μg/ml não tem efeito sobre o metabolismo de HDFs (Fig. 3A). A exposição ao CS/PB sem vírus também não apresenta efeito tóxico sobre as células (dados não mostrados). A análise por FACS de HDFs transduzidas com vírus mais diversas concentrações de CS/PB mostra aumento da transdução em comparação com PB isolado (Fig. 3B). O máximo de potencialização ocorre em 100 μg/ml de CS/PB (Fig. 3C), várias vezes menor do que os valores previamente relatados.³ Assim, é importante otimizar as condições para qualquer tipo celular-alvo específico.

A complexação com CS/PB aumenta aproximadamente 3 vezes o título observado em Slc-hRMS (Fig. 4A, p < 0,01). Na prática, isso resulta em um efeito maior na eficiência de transdução em concentrações baixas de vírus do que em concentrações mais altas (Fig. 4B), o que provavelmente se deve à transdução múltipla de células e à saturação de receptores em concentrações elevadas de vírus.

A transdução com vírus ectrópico é específica para células que expressam o receptor de retrovírus murino. Ao transduzir células humanas não modificadas com vírus ectrópico, não observamos fluorescência superior ao fundo de não transdução, independentemente do uso de PB ou CS/PB, conforme mostrado na Figura 5A. Microscopicamente, os HDFs não mostram transdução na ausência do receptor (Figura 5B), enquanto a pré-transdução com o receptor resulta em células fluorescentes (Figura 5C).

Figura 1. Representação esquemática de (A) o processo de produção do vírus e (B) a transdução de células humanas com receptor retroviral murino seguida por lentivírus ecotrópico.

Figura 2. Transdução de alta eficiência de células humanas com lentivírus ecótrofico codificando GFP. As células foram previamente transduzidas com o receptor de retrovírus murino Slc7a1. (A) Linhagem celular de rabdomiossarcoma humano selecionada com blasticidina para Slc7a1 (Slc-hRMS), transduzida (azul) ou não transduzida (rosa) com GFP. (B) Micrografia fluorescente de Slc-hRMS transduzidas com vírus ecótrofico (4X). (C) HDFs transduzidas (azul) e não transduzidas (rosa) com lentivírus ecótrofico GFP; as células foram transduzidas com Slc7a1 dois dias antes da transdução ecótrofica. (D) Título do lentivírus pseudotipado com VSV-G e do lentivírus ecótrofico, medido em Slc-hRMS.

Figura 3. Otimização das concentrações de sulfato de condroitina/polibreno (CS/PB) em fibroblastos dérmicos humanos. (A) Viabilidade de HDFs medida pelo ensaio MTT após transdução na presença de PB apenas ou com diferentes concentrações de CS/PB. (B) Melhoria da eficiência de transdução em HDFs com diferentes concentrações de CS/PB, medida por FACS. (C) Quantificação do aumento da transdução, mostrando que a transdução máxima ocorre com 100 μg/ml de CS/PB.

Figura 4. Efeito de 400 μg/ml de CS/PB na transdução de Slc-hRMS com lentivírus ecotrópico. (A) Aumento do título e (B) mudança na taxa de transdução em relação a 6 μg/ml de polibreno isolado.

Figura 5. Ausência de transdução ecotrópica de HDFs na ausência do receptor de retrovírus murino Slc7a1. (A) Gráfico de citometria de fluxo de fibroblastos humanos BJ, não transduzidos (rosa) ou transduzidos (azul) com lentivírus ecotrópico GFP, em ambos os casos na ausência do receptor Slc7a1. Fibroblastos humanos BJ transduzidos com lentivírus ecotrópico GFP, sem (B) e com (C) pré-transdução com o receptor Slc7a1 (4X).

Discussão

Recombinante gammaretrovirus ecotropic baseado em Moloney vírus da leucemia murina (MLV) e seu receptor mSlc7a1 são bem estudadas e amplamente disponível, tendo sido utilizada por mais de 20 anos para entregar transgenes em células de camundongos. Gammaretrovirus Ecotropic também tem sido usado mais recentemente para entregar oncogenes às células humanas;. No contexto da reprogramação celular, o uso de mSlc7a1 para evitar a geração de vírus amphotropic abrigar oncogenes humanos está bem estabelecida ^4,5 No entanto, lentivírus oferece vantagens significativas sobre gammaretrovirus na transdução de populações de células refratário, ^6, incluindo células primárias que muitas vezes são alvos desejáveis ​​para a reprogramação, porque o complexo de pré-integração lentiviral permite transdução de não-divisão das células. ⁷

Lentivírus têm sido produzidos com dezenas de pseudotipos diferentes, incluindo MLV, em um esforço para alterar o tropismo do vírus, toxicidade e outras propriedades. ⁸ lentivírus ecotropic MLV-pseudotyped tem sido usado para a transdução de células mouse, ^9, mas raramente tem sido utilizado em células humanas . ¹⁰ Por isso, propomos o uso de MLV-pseudotyped lentivírus ecotropic como um veículo de custo, seguro e eficaz, e altamente eficiente para entregar oncogenes conhecidos ou suspeitos, incluindo celulares fatores de reprogramação, para as células humanas.

É fundamental notar que este protocolo não eliminar totalmente a necessidade de produzir e utilizar lentivírus pantropic, mas sim, este protocolo separa o oncogene (s) de que o vírus pantropic, isolando pesquisadores do potencial de auto-inoculação com câncer relacionados com o vírus. O mSlc7a1 proteína e sua hSlc7a1 homólogo humano são expressos ubiquitously transportadores de aminoácidos sem tumorigenicidade conhecidos ou capacidade de conferir uma vantagem seletiva em células de crescimento destinatário, ¹¹ mSlc7a1 realização de um risco relativamente baixo para incorporação vírus amphotropic. Esta etapa adicional pode ser particularmente útil em laboratórios de vírus falta dedicado ou a cultura de tecidos do nível de biossegurança exigido.

Em algumas situações pode ser possível eliminar completamente o uso de vírus pantropic por transfecting o Slc7a1 plasmídeo diretamente em células-alvo, no entanto, muitas células que seriam alvos úteis desta técnica também são refratários a transfecção. Como alternativa, a capacidade de isolar Slc7a1-transduzidas células pela seleção blasticidin significa que VSV-G lentivírus pseudotyped pode ser usado uma vez para gerar um estoque de células que expressam receptores, após o qual o vírus ecotropic pode ser usada rotineiramente para transduzir essas células para muitos experimentos. Pesquisadores devem sempre seguir as suas orientações de segurança institucional para trabalhar com qualquer lentivírus, independentemente do seu tropismo.

Os títulos de vírus ecotropic alcançado com este protocolo são moderadamente inferiores VSV-pseudotyped vírus, geralmente 10-20% do título de vírus pantropic, de acordo com estudos anteriores. ⁹ Estes títulos foram medidos em células humanas de maneira estável transduzidas com Slc7a1, de modo a diminuir título observado para o vírus ecotropic pode ser em parte devido a expressão variada do gene do receptor em células-alvo. No entanto, os títulos virais obtidas em nosso protocolo são mais do que suficiente para a maioria das aplicações e levar a transdução de a maioria das células, em alguns casos> 90% das células.

Centrifugação técnicas baseadas são comumente usados ​​para concentrar as partículas virais. No entanto, requer várias horas de centrifugação, gera aerossóis infecciosos, e pode resultar em perda significativa de partículas virais. ¹² Como alternativa, a complexação com CS / PB pode ser usado para melhorar a transdução sem alterar tropismo viral. ³ Este método é rápido (5 minutos ) e barato (US $ 0,03 por 10 ml de vírus), enquanto cerca de triplicar o título observados. Nenhum equipamento especial ou reagentes de propriedade são necessários, e observou-se toxicidade aguda após a exposição mínima de HDFS para CS / PB, de acordo com trabalhos anteriores em outras linhagens celulares. ¹³ Uma desvantagem potencial deste protocolo é que alguns complexos microscopicamente visível polímero aderir as células durante vários dias em cultura. Não podemos descartar a possibilidade de que estes complexos, embora não abertamente tóxicos para as células, pode ter efeitos mais sutis sobre os processos celulares.

Aqui nós descrevemos uma metodologia para a segurança e eficiência transdução de células humanas com fatores oncogênicos. Esta abordagem deve ser de grande utilidade para pesquisadores que estudam oncogenes e biologia de células-tronco, incluindo as células iPS.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
pLenti6/UbC/mSlc7a1	Addgene	17224	Receptor MLV murino
pMD2.G	Addgene	12259	VSV-G envelope
pCMV-dR8.91	D. Trono laboratório 14		Embalagem plasmídeo (psPax2 plasmídeo equivalente está disponível a partir Addgene, Cat. Número 12260)
pHCMV-EcoEnv	Addgene	15802	Envelope Ecotropic
FUGW	Addgene	14883	GFP controle plasmídeo
OptiMEM	Invitrogen	31985
Fugene HD	Roche	04 709 705 001
Hexadimetrina brometo (polibrene)	Sigma-Aldrich	H9268
Condroitina sal sulfato de sódio de cartilagem de tubarão	Sigma-Aldrich	C4384
Blasticidin S	Pescador	BP 2647100
Metiltiazolildifenil-brometo de tetrazolium (MTT)	Sigma-Aldrich	M2128
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I3021