Análise por Citometria de fluxo das células imunológicas Dentro aortas murino

Resumo

Este trabalho apresenta um método de citometria de fluxo baseado em investigar a composição imune de aortas. O documento também ilustra uma técnica adicional que permite examinar adventícia circundante e parede do vaso separadamente. Esse método abre possibilidades para realizar análises fenotípica de leucócitos aórtica e aplicar vários ensaios imunológicos para estudos de aterosclerose.

Resumo

A aterosclerose é um processo inflamatório crônico dos vasos de tamanho médio e grande porte que se caracteriza pela formação de placas consistindo em células espumosas, células imunes, vascular células endoteliais e musculares lisas, plaquetas, matriz extracelular, e um núcleo rico em lipídios, com extensa necrose e fibrose dos tecidos circundantes. Os braços ^uma inata e adaptativa da resposta imune estão envolvidos na iniciação, desenvolvimento e persistência da aterosclerose. ^{2, 3} Existe um corpo significativo de evidências de que os diversos subgrupos da células do sistema imunológico, tais como macrófagos, dendríticas células, os linfócitos T e B, estão presentes na aorta de ratos saudáveis ​​e aterosclerose propensas a ^4. Além disso, as células imunológicas são encontrados na adventícia da aorta ao redor, o que sugere um papel importante deste tecido na aterogênese ^2.

Por algum tempo, a detecção quantitativa de diferentes tipos de células do sistema imunológico, o seu estado de ativação e da composição celular dentro da parede da aorta foi limitado pela RT-PCR e métodos de imuno-histoquímica para o estudo da aterosclerose. Foram feitas algumas tentativas para executar a citometria de fluxo utilizando aortas humanas, e uma série de problemas, como um autofluorescência alta, têm sido relatados ^5,6. Humana placas ateroscleróticas foram digeridos com colagenase 1 e células livres foram coletadas e coradas para CD14 + / CD11c + para realçar as células de macrófagos derivados de espuma. Neste estudo, um canal de "mock" foi usado para evitar falsos-positivos de coloração. ⁶ materiais Necrotic acumulando durante o processo de digestão dar origem em uma grande quantidade de detritos que gera uma alta autofluorescência em amostras da aorta. Para resolver esse problema, um painel de controles negativo e positivo tem sido proposto, mas apenas a coloração dupla pode ser aplicado nessas amostras. Nós desenvolvemos um novo método de citometria de fluxo baseado em ⁷ a analisar a composição das células imunológicas e caracterizar a ativação, proliferação, diferenciação de células do sistema imunológico em aorta saudável e propenso a aterosclerose. Este método permite a investigação da composição das células imunológicas da parede da aorta e abre possibilidades de usar um amplo espectro de métodos imunológicos para investigação de aspectos imunológicos da doença.

Protocolo

1. Isolamento de aortas de camundongos

Aprovação do comitê institucional IACUC do procedimento é necessário para trabalhar com camundongos.

1. Prepare heparinzed PBS, acrescentando 1.000 unidades de heparina sódica a 50 ml de PBS e invertendo o tubo para misturar. Prepare um tubo de coleta vazio para o sangue e um tubo de coleta contendo PBS para cada aorta a ser coletado. Manter todos os tubos no gelo.
2. Heparinizar uma seringa de sangue de desenho (0,1 ml de Heparina sódica 1.000 U / ml), prepare instrumentos cirúrgicos (dois pares de fórceps curvado, um par de tesouras de dissecação, e um par de microshears), e um estág....

Discussão

Aqui, apresentamos um método de citometria de fluxo baseada na investigação da composição das células imunológicas de aortas de camundongos. A principal vantagem deste método é a capacidade de analisar aórtica células do sistema imunológico em uma única célula e níveis para caracterizar o status de ativação de leucócitos aórtica. Este método não é restrito a aortas de camundongos e nós (dados não publicados) e outros ¹⁰ usado essa abordagem para analisar amostras humanas, tais como artéria mamária interna, vá.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Material	Número de catálogo	Companhia
Colagenase XI	C7657	Sigma-Aldrich
Hialuronidase	H3506	Sigma-Aldrich
DNase I, tipo 2	D4527	Sigma-Aldrich
Colagenase I	C0130	Sigma-Aldrich
Colagenase II	LS004174	Worthington Corporação Bioquímica
Elastase	LS002292	Worthington Corporação Bioquímica