Artigo de método

Geração robusto de Hepatócito-like Células de populações humanas células-tronco embrionárias

DOI:

10.3791/2969

⸱

26 de outubro de 2011

 ,  ,  ,  , 
1Medical Research Council Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh

Neste artigo

Resumo

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Este artigo incidirá sobre a geração de endoderme hepática humana de populações humanas de células-tronco embrionárias.

Resumo

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Apesar dos progressos na modelagem de toxicidade dos medicamentos humanos, muitos compostos falhar durante os ensaios clínicos devido a efeitos colaterais imprevisíveis. O custo de estudos clínicos são substanciais, por isso, é essencial que mais telas de toxicologia preditiva são desenvolvidos e implantados no início do desenvolvimento de drogas (Greenhough et al 2010). Hepatócitos humanos representam o modelo atual do ouro padrão para avaliar a toxicidade dos medicamentos, mas são um recurso limitado que exibem função variável. Portanto, o uso de linhagens de células imortalizadas e modelos de tecido animal são rotineiramente empregados devido à sua abundância. Enquanto ambas as fontes são informativos, eles são limitados pela função pobres, a variabilidade das espécies e / ou instabilidade na cultura (Dalgetty et al 2009). Células-tronco pluripotentes (PSC) são uma importante fonte alternativa de hepatócitos humanos como células (HLCS) (Medine et al 2010). PSCs são capazes de auto-renovação e diferenciação de todos os tipos de células somáticas encontrada no adulto e, portanto, representamuma fonte potencialmente inesgotável de células diferenciadas. Temos desenvolvido um procedimento que é simples, altamente eficiente, passível de automação e rendimento funcional HLCS humano (Hay et al 2008; Fletcher et al 2008; Hannoun et al 2010; Payne et al 2011 e Hay et al 2011). Acreditamos que nossa tecnologia irá levar à produção escalonável de HLCS para descoberta de drogas, modelagem de doença, a construção de extra-corpórea dispositivos e, possivelmente, terapias celulares transplante base.

Protocolo

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1. Preparação inicial de todas as ações químicas e revestimento da cultura plasticware

Todos os passos a serem realizadas em uma capa de cultura de tecidos sob condições assépticas.

  1. Preparação de fator de crescimento básico de fibroblastos humanos (hbFGF)
    1. Prepare solução de 10% BSA em PBS e filtrar através de um filtro de 0,22 mM.
    2. A partir da solução BSA 10% preparar uma solução de 0,2% BSA.
    3. Adicionar 10 mL de 0,2% BSA hbFGF mg solution/100.
    4. Pré-molhada 0,22 mM um filtro por filtragem 5 mL de solução BSA 10% através do filtro. Descartar a 10 mL BSA lavagem.
    5. Filtrar o hbFGF através d....

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Discussão

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Nós desenvolvemos um modelo simples, homogêneo e altamente reprodutível in vitro para gerar níveis escalável de HLCS humana. Nosso modelo foi validado por uma série de laboratórios colaboradores externos. Rotineiramente caracterizar HLCS com células-tronco derivadas usando a nossa caixa de ferramentas na casa de marcadores específicos de desenvolvimento e testes funcionais do fígado (a maioria dos quais estão disponíveis comercialmente). As fases críticas em nosso processo são: a manutenção da pluripotência das.......

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Divulgações

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Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

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Dr Hay foi apoiado por uma bolsa RCUK, o Dr. West foi apoiado pelo Departamento de Cirurgia, Dr. Medine foi apoiado por uma subvenção do Fundo Núcleo BHF, o Sr. Baltasar Lucendo-Villarin foi apoiado por um PhD MRC Studenship. Dr. Zhou foi apoiado por uma bolsa do governo chinês.

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Materiais

Placas de revestimento Matrigel e frascos

  1. Matrigel (10 mL, BD Biosciences, UK); armazenar a -20 ° C.
  2. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar a 4 ° C.
  3. Placas de cultura de tecido (6 assim, 12 bem, Corning, UK)
  4. Frasco de cultura de tecidos (25 cm2 ventiladas, Corning, UK)

Manutenção CTEh

  1. Rato médio de fibroblastos embrionários condicionado (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, EUA); armazenar a -20 ° C.
  2. BSA solução (50 mL, Sigma Aldrich, UK); armazenar a 4 ° C.
  3. Fator de crescimento básico de fibroblastos humanos (100 mg, Peprotech, EUA); armazenar a -20 ° C.

HESCs Passaging com colagenase

  1. Bem confluentes ou frasco de hESCs.
  2. Matrigel poços revestidos ou frascos conforme o caso.
  3. Fosfato salina tamponada (-MgCl 2, CaCl-2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar à temperatura ambiente.
  4. Colagenase IV (1 g, Gibco, InvitrOgen, UK); armazenar a 4 ° C.
  5. Rato médio de fibroblastos embrionários condicionado (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, EUA).
  6. Fator de crescimento básico de fibroblastos humanos (100 mg, Peprotech, EUA).

Diferenciação de hESCs a endoderme hepática

  1. RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar a 4 ° C.
  2. Suplemento B27 (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar a -20 ° C.
  3. Ativina A (2 mg, Peprotech, EUA); armazenar a -20 ° C.
  4. Recombinante Wnt3a mouse (2 mg, R & D Systems, EUA); armazenar a -20 ° C.
  5. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar a 4 ° C.
  6. KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar a -20 ° C.
  7. Não-aminoácidos essenciais (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar a 4 ° C.
  8. β-mercaptoetanol (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar a 4 ° C.
  9. DMSO (Sigma Aldrich, UK); armazenar à temperatura ambiente
  10. Leibovitz L-15 meio de cultura (500 mL, Sigmuma Aldrich, UK); armazenar a 4 ° C.
  11. Triptose fosfato de caldo de carne (100 mL, Sigma Aldrich, UK); armazenar a 4 ° C.
  12. Fetal de soro bovino, inactivado pelo calor (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar a -20 ° C.
  13. Armazenar a -20 ° C.; hidrocortisona 21 hemissuccinato (100 mg, Sigma Aldrich, UK)
  14. Insulina (pâncreas bovino) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); armazenar a -20 ° C.
  15. L-Glutamina (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar a -20 ° C.
  16. O ácido ascórbico (25 g, Sigma Aldrich, UK); armazenar a -20 ° C.
  17. Humana HGF (10 mg, Peprotech, EUA); armazenar a -20 ° C.
  18. Recombinante humana Oncostatina M (OSM) (50 mg, R & D Systems, EUA); armazenar a -20 ° C.
  19. Seringa de unidade orientado filtro de 0,22 mM (Millipore, UK)

Caracterização da CTEh endoderma hepática derivada

Imunocoloração

  1. Tampão fosfato salino (-MgCl 2, CaCl-2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store à temperatura ambiente.
  2. PBST, PBS feita com 0,1% de Tween 20 (Sigma-Aldrich, UK).
  3. Paraformaldeído (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) é composto, em PBS, armazenar -20 ° C.
  4. Glicerol (Sigma-Aldrich, UK), armazenar em temperatura ambiente.
  5. Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), armazenar em temperatura ambiente.
  6. Etanol
  7. Soro (ABD Serotech, UK), armazenar a -20 ° C.
  8. Anticorpo secundário, fluoróforos Alexa (Molecular Probes, Invitrogen, UK).
  9. MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, EUA) é composta de Tris HCL e glicerol como por instruções dos fabricantes. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) é adicionado à solução MOWIOL na diluição de 1:1000.
Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anticorpos primários
* Antígeno Tipo Fornecedor Diluição
ALB Monoclonal de camundongo Sigma Aldrich 05/0100
E-caderina Monoclonal de camundongo Millipore 1 / 100
α-fetoproteína Monoclonal de camundongo Sigma 1 / 500
SSEA-4 FITC Monoclonal de camundongo Biolegend 1 / 100
IgG Monoclonal de camundongo DAKO 1 / 500
Anticorpos secundários
Anti-camundongo conjugado FITC Cabra Monoclonal Invitrogen 1 / 400

Tabela 2. Os anticorpos utilizados para CTEh imunocoloração derivados hepática endoderme, as concentrações utilizadas, a espécie desenvolveu e as empresas que são comprados a partir de.

Análise funcional do endoderma hepática e normalização (por mg de proteína)

citocromo P450 Ensaios

  1. p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits e luminômetro (Promega, EUA).
  2. Branco flat bottom 96 placa de ensaio bem (BD Biosciences, UK).
  3. BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK).
  4. 96 placa transparente de ensaio bem (IWAKI, UK)

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology. J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).
  2. Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D.

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