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1. Criação de variantes BRCA1 usando ferramentas de edição de base mediadas por CRISPR
>NOTA: Se as linhagens celulares HAP1-BE3 não forem usadas, o DNA do plasmídeo codificador de BE3 pode ser co-transfectado com o gRNA direcionado a BRCA1. Em comparação com a co-transfecção de plasmídeos BE3 e gRNA, a transfecção de plasmídeo gRNA para células HAP-BE3 induz uma edição de base eficiente em até 3 vezes no locus alvo em nossas mãos.
- Semear 5 x 105 células HAP1-BE3 (ou células HAP1 no caso de métodos de co-transfecção) por poço em placas de 24 poços 1 dia antes da transfecção. No momento da transfecção, as células de cultura atingem uma densidade apropriada (70% a 80% de confluência).
- Transfectar gRNAs direcionados a BRCA1 usando os reagentes de transfecção adquiridos (Tabela de Materiais) de acordo com o protocolo do fabricante. Use 1 μg de gRNAs direcionados a BRCA1 (com 1 μg de DNA de plasmídeo codificador de BE3 no caso de métodos de co-transfecção) para induzir a conversão de C: G para T: A em locais alvo de BRCA1. Incubar as células a 37 °C e subcultivar a cada 3-4 dias.
- Colha os pellets celulares 3, 10 e 24 dias após a transfecção para analisar as eficiências de edição de base (as amostras de 3 dias após a transfecção são analisadas como amostras do dia 0).
- Extraia DNA genômico usando o kit de purificação de DNA genômico (Tabela de Materiais).
NOTA: Recomendamos otimizar as condições de transfecção com proporção variável de reagente para DNA. A condição ideal para a transfecção de HAP1 é a proporção de 4:1 de reagente para DNA em nossas mãos.