Ferramentas de edição de base mediadas por CRISPR: uma técnica de edição de genoma para induzir a substituição de base direcionada

Resumo

Fonte: Ver, J. E., et al. Avaliação funcional de variantes BRCA1 usando editores de base mediados por CRISPR. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo explica o conceito de editores de base de citosina mediados por CRISPR para induzir a substituição de nucleotídeos direcionados.

Protocolo

1. Criação de variantes BRCA1 usando ferramentas de edição de base mediadas por CRISPR

>NOTA: Se as linhagens celulares HAP1-BE3 não forem usadas, o DNA do plasmídeo codificador de BE3 pode ser co-transfectado com o gRNA direcionado a BRCA1. Em comparação com a co-transfecção de plasmídeos BE3 e gRNA, a transfecção de plasmídeo gRNA para células HAP-BE3 induz uma edição de base eficiente em até 3 vezes no locus alvo em nossas mãos.

1. Semear 5 x 10⁵ células HAP1-BE3 (ou células HAP1 no caso de métodos de co-transfecção) por poço em placas de 24 poços 1 dia antes da trans....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lipofectamina 2000	Thermo Fisher Científico	11668027	Reagente de transfecção
Opti-MEM	Gibco	31985070	Materiais de transfecção
Reagente de transfecção FuGENE HD	Promega	E2311	Reagente de transfecção
Iscove modificou o meio de Dulbecco	Gibco	12440046	Meio para células HAP1
lentiCas9-Blast	Addgene	Rolamento 52962	DNA de plasmídeos para clonagem de lentiBE3
Kit de Sangue e Tecido DNeasy	Qiagen	Nº 69504	Kit de preparação de DNA genômico