Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Instalação do software
- Siga as instruções para instalar o software a partir do https://github.com/bsbrl/Autoinjector.
2. Preparação de reagentes e pipetas
- Agarose: Prepare agarose a 3% dissolvendo separadamente 3 g de agarose de ampla gama e 3 g de agarose de baixo ponto de fusão em 100 mL de PBS de grau de cultura de células em dois frascos de vidro separados de 200 mL, respectivamente. Armazene em temperatura ambiente por até 3 meses.
- Solução de Tyrode: Dissolva 1 g de bicarbonato de sódio e sal de Tyrode (use o conteúdo de todo o frasco) e 13 mL de HEPES 1 M em 1 L de água destilada. Ajuste o pH para 7,4. Filtrar a solução através de um filtro de 0,2 μm.
- Meio de cultura de fatias (SCM): Adicione 10 mL de soro de rato, 1 mL de glutamina 2 mM, 1 mL de penicilina-estreptomicina (100x), 1 mL de suplemento N-2 (100x), 2 mL de suplemento B27 (50x) e 1 mL de tampão HEPES (pH 7,3) em 84 mL de meio neurobasal. Alíquota de 5 mL de SCM em tubos de 15 mL. Conservar a -20 °C.
- Meio de microinjeção independente de CO2 (CIMM): Prepare 5x solução de baixa glicose modificada com DMEM (sem vermelho de fenol) dissolvendo o pó em 200 mL de água destilada. Filtre a solução através de um filtro de 0,2 μm (para o pó DMEM, use o conteúdo de todo o frasco). Para preparar 100 mL de CIMM, misture 20 mL de solução modificada 5x DMEM, 1 mL de tampão HEPES, 1 mL de suplemento de N2 (100x), 2 mL de suplemento de B27 (50x), 1 mL de penicilina-estreptomicina (100x), 1 mL de glutamina 2 mM e 74 mL de água destilada. Conservar a solução a 4 °C.
- Tampão de reconstituição: Prepare o tampão de reconstituição dissolvendo 262 mM NaHCO₃, 0,05 N NaOH, 200 mM HEPES em água destilada. Esterilize a solução por filtração através de um sistema de filtro de 0,22 μm em um frasco de vidro estéril. Alíquota de 500 μL de tampão de reconstituição em tubos de microcentrífuga herméticos. Conservar a 4 °C.
- Estoque de corante de microinjeção: Dissolva o Dextran marcado com fluorescência em água destilada livre de RNase (concentração final de 10 μg/μL). Preparar alíquotas de 5 μL e conservar a -20 °C até à utilização.
- Puxe as pipetas de microinjeção dos capilares de vidro borossilicato (1,2 mm de diâmetro externo, 0,94 mm de diâmetro interno) usando o extrator de micropipeta. Proteja as pipetas da poeira. Não armazene pipetas por mais de 2 a 3 dias. Para este experimento, os parâmetros de tração foram CALOR: temperatura da rampa +1 – 5; TRAÇÃO: 100; VEL: 110; DEL: 100. HEAT e VEL são os parâmetros que mais afetam a forma e o tamanho da pipeta.
nota: A pipeta de microinjeção ideal tem uma ponta longa e flexível, para evitar danos às células durante a microinjeção.
3. Preparação da fatia de tecido
- Derreta a agarose de 3% de largura usando um forno de micro-ondas antes da dissecção do tecido cerebral. Não deixe a agarose solidificar mantendo-a em banho-maria a 37 °C antes de ser incorporada. Certifique-se de que as pipetas estejam protegidas contra poeira. Não armazene pipetas por mais de 2 a 3 dias.
- Descongelar uma alíquota de SCM e aquecer 10-12 ml de CIMM e 20 ml de solução de Tyrode a 37 °C em banho-maria.
- Misture o marcador fluorescente (Dextran-3000 ou Dextran-10000-Alexa conjugado; concentração final de 5 a 10 μg/μL) com o(s) outro(s) produto(s) químico(s) a ser injetado(s). Centrifugar a solução de microinjecção a 16 000 x g durante 30 min a 4 °C. Recolher o sobrenadante e transferir para um novo tubo. Mantenha a solução de microinjeção no gelo até o uso.
- Use as cabeças de embriões de camundongos E13.5–E16.5 para preparar fatias de tecido organotípico do telencéfalo. Remova a pele e abra o crânio usando a pinça, movendo-se ao longo da linha média. Disseque o cérebro embrionário do crânio aberto e remova as meninges que cobrem o tecido cerebral a partir do lado ventral do cérebro. Deixar todo o cérebro dissecado na solução de Tyrode num bloco de aquecimento a 37 °C.
nota: Todas as etapas de dissecção descritas no ponto 3.4 devem ser executadas em solução de Tyrode pré-aquecida.
- Despeje a ampla variedade de agarose derretida em um molde de incorporação descartável. Quando a agarose for resfriada a 38–39 °C, transfira cuidadosamente os cérebros (no máximo 4) para ela usando uma pipeta Pasteur. Sempre use pontas de corte para esta etapa.
- Mexa a agarose ao redor do tecido usando uma espátula ou um par de pinças Dumont # 1 sem tocar no tecido. Deixe a agarose solidificar à temperatura ambiente. Assim que a agarose solidificar, corte o excesso de agarose ao redor do tecido.
- Encha a bandeja de buffer com PBS. Oriente o cérebro com o eixo rostro-caudal do tecido perpendicular à bandeja (use como ponto de referência os bulbos olfatórios, representando a parte mais rostral do cérebro). Cortar fatias de 250 μm com um vibratoma.
- Encha uma placa de Petri de 3,5 cm com 2 mL de meio pré-aquecido. Usando uma pipeta de plástico Pasteur, transfira as fatias (10–15) para este prato. Uma vez feito isso, coloque a placa de Petri com as fatias na incubadora de cultura de fatias. Mantenha as fatias a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 40% de O2 / 5% CO2 / 55% N2 até o uso.
4. Microinjeção
- Ligue o computador, o microscópio, a câmera do microscópio, os manipuladores, o equipamento de pressão e o sensor de pressão. Carregue o aplicativo clicando no arquivo "launchapp.py" na pasta principal baixada do GitHub e especifique as configurações do dispositivo na tela pop-up (consulte a etapa 1.1 para obter instruções de instalação).
- Crie uma pressão externa para evitar entupimentos indesejados antes de submergir a pipeta na solução. Para aplicar pressão à pipeta, deslize a barra de pressão de compensação para 24–45% e clique em Definir valores. Em seguida, ajuste a pressão para uma pressão suficiente girando o botão da válvula de pressão mecânica para 1–2 PSI (69–138 mbar) conforme indicado pelo sensor de pressão.
- Transfira as fatias para uma placa de Petri de 3,5 cm contendo 2 mL de CIMM pré-aquecido. Coloque as fatias a serem microinjetadas no centro da placa de Petri. Transferir a placa de Petri para a fase de microinjecção pré-aquecida (37 °C).
- Carregue a pipeta de microinjeção com 1,4–1,6 μL de solução microinjetada (da etapa 3.3) usando uma pipeta de plástico de ponta longa. Insira a pipeta de microinjeção no suporte da pipeta.
- Usando a menor ampliação no microscópio, coloque o corte em foco e guie a micropipeta para este campo de view (FOV) para que ele seja focado no mesmo plano que o alvo do corte. Mude a saída do microscópio para a câmera para ver o FOV na aplicação.
- Clique no botão de ampliação no canto superior esquerdo da interface para iniciar a calibração do dispositivo. Uma janela solicitará a seleção da ampliação. Selecione a ampliação de 10x ou qualquer ampliação para a qual a lente esteja definida (por exemplo, 4x, 10x, 20x, 40x) e pressione Ok. O software assume que a lente objetiva interna é de 10x (a ampliação mais comum da lente objetiva).
- Focalize novamente a ponta da pipeta usando a roda micrométrica do microscópio e clique na ponta da pipeta com o cursor. Em seguida, pressione o botão da etapa 1.1 e pressione OK na janela pop-up. A pipeta se moverá na direção Y. Clique na ponta da pipeta e pressione o botão passo 1.2. Por fim, insira 45 na caixa Ângulo da pipeta e pressione o botão Definir ângulo.
- Insira os parâmetros desejados no painel de controles de microinjeção automatizada. Para microinjeção em progenitores apicais, defina a distância de injeção para 20–40 μm e a profundidade para 10–15 μm. Para microinjeção em neurônios, defina a distância de injeção de 30 a 40 μm do lado basal e a profundidade de 10 a 30 μm, dependendo do que está sendo direcionado. Sempre defina a velocidade para 100%. Clique em Definir valores.
nota: A distância de aproximação é a distância que a pipeta puxa para fora do tecido antes de passar para a próxima distância de injeção, a profundidade é a profundidade no tecido que a microinjeção vai, o espaçamento é a distância ao longo da linha entre as injeções sequenciais, a velocidade é a velocidade da pipeta em μm/s.
- Clique no botão Desenhar borda e arraste o cursor ao longo da trajetória desejada na janela pop-up para definir a trajetória da injeção. Para microinjetar células-tronco progenitoras, o lado ventral da superfície do telencéfalo é direcionado. Traga a pipeta para o início da linha e clique na ponta da pipeta. Clique em Executar trajetória para iniciar a microinjetação. Repita esta etapa para cada plano de injeção direcionado (geralmente feito para 3 a 4 planos com 40 a 75 injeções por plano).
