Cromatografia Líquida de Interação Hidrofílica: Uma Técnica para Separar Analitos Polares Hidrofílicos Usando Grânulos Hidrofílicos

Resumo

Fonte: Liu, D., et al. Análise de N-glicano de imunoglobulina G por cromatografia líquida de ultra-desempenho. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demonstra o princípio da separação de compostos polares hidrofílicos usando cromatografia líquida de interação hidrofílica. Essa técnica auxilia na purificação de vários analitos polares, incluindo N-glicanos.

Protocolo

1. Cromatografia de interação hidrofílica e análise de glicanos

1. Condicionamento de instrumentos UPLC e preparação de fases móveis
   1. Prepare fases móveis, incluindo solvente A: formato de amônio 100 mM (pH = 4,4), solvente B: 100% acetonitrila, solvente C: 90% de água ultrapura (10% de metanol) e solvente D: 50% de metanol (água ultrapura).
   2. Abra o software para controlar as fases móveis.
   3. Lave os instrumentos UPLC a uma taxa de fluxo de 0,2 mL/min (50% de solvente B e 50% de solvente C) balanceando por 30 min, depois a uma taxa de fluxo de 0,2 mL/min (25% de solvente A e 75% de solvente B) balanceando por 20 min e, em seguida, uma taxa de fluxo de 0,4 mL/min de balanceamento.
2. Dissolva os N-glicanos pré-marcados com 2-aminobenzamida (2-AB) em 25 μL de uma mistura de 100% de acetonitrila e água ultrapura na proporção de 2:1 (v/v). Em seguida, centrifugue a 134 × g por 5 min (4 ° C) e carregue 10 μL dos N-glicanos marcados nos instrumentos UPLC.
3. Separe os N-glicanos marcados a uma taxa de fluxo de 0,4 mL / min com um gradiente linear de 75% a 62% de acetonitrila por 25 min. Em seguida, execute uma execução analítica por escada de calibração de dextrana / coluna de glicopeptídeos em um UPLC a 60 ° C (aqui, as amostras foram mantidas a 4 ° C antes da injeção).
4. Detectar fluorescência de N-glicano em comprimentos de onda de excitação e emissão de 330 nm e 420 nm, respectivamente.
5. Integre os glicanos com base na posição de pico e no tempo de retenção.
6. Calcule o valor relativo de cada pico de glicano (GP)/ todos os picos de glicano (GPs) (porcentagem, %) da seguinte forma: GP1: GP1/GPs*100, GP2: GP2/GPs*100, GP3: GP3/GPs*100, etc.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-aminobenzamida, 2-AB	Sigma, China
Acetonitrilo	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Formato de amônio	Fornecedor verificado - Beijing Minruida Technology Co., Ltd.
Escada de calibração de dextrano/coluna de glicopeptídeos	Watts technology Co., Ltd, China
Capacitar 3.0	Waters technology Co., Ltd, América
Kit de rotulagem GlycoProfile 2-AB	Sigma, China
metanol	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Medidor de água pura Milli-Q	Millipore Co., Ltd, América	202-2AB
Pistola de transferência de líquido	Smer Fell Ciência e Tecnologia Co., Ltd, China	Vantagem A10
Geladeira de temperatura ultrabaixa	Thermo Co., Ltd, América	PB-10
Cromatografia líquida de ultra-eficiência	Watts technology Co., Ltd, China
Bomba de vácuo	Watts technology Co., Ltd, China	4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl