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1. Derivatização de fluorescência de ácidos siálicos
- Prepare 10 mL de solução de OPD, consistindo de 100 mg de o-fenilenodiamina e 208 mg de hidrogenossulfito de sódio em 10 mL de H₂O destilado.
- Adicione 20 μL de solução de OPD às amostras de ácido siálico. Vortex vigorosamente por 30 s e incubar amostras por 4 h a 80 ° C no escuro (ou seja, embrulhar os microtubos em papel alumínio).
- Deixe as amostras esfriarem por 5 min, adicione 80 μL de H₂O destilado e centrifugue os tubos a 14.000 x g por 1 min.
- Transfira 80 μL do sobrenadante para um frasco para HPLC de 300 μL de alta recuperação. As amostras de ácido siálico derivatizado podem ser armazenadas a 4-6 °C por até uma semana.
2. Análise por HPLC de derivados do ácido siálico
- Analise as amostras usando um sistema HPLC padrão conectado a um detector de fluorescência online.
- Use uma coluna C18 de fase reversa com as dimensões padrão de 250 mm de comprimento e 4,6 mm de diâmetro para a análise.
- Preparar o solvente A diluindo 200 ml de solução-mãe com 800 ml de água de qualidade LCMS (LCMS - espectrometria de massa por cromatografia líquida). A própria solução de estoque pode ser preparada da seguinte forma:
- Adicione 46 g de ácido fórmico a 800 mL de H₂O de grau LCMS.
- Ajuste o pH para 4,5 adicionando gota a gota a solução de hidróxido de amônio (puriss. p.a.).
- Transfira o solvente para um cilindro medidor e encha até 1.000 mL com H₂O de grau LCMS. Esta solução de reserva pode ser conservada a 4-6 °C durante um período máximo de 3 meses.
- Para o solvente B, use acetonitrila de grau LCMS.
- Separar os derivados dos ácidos siálicos a um débito de 1 ml/min com a seguinte eluição gradiente:
- Comece adicionando 10% do solvente B misturado ao solvente A.
- De 0 min a 15 min, aumente gradualmente a proporção de solvente B com um gradiente linear para 60%.
- De 15 min a 16 min, aumente rapidamente a proporção de solvente B com um gradiente linear de 60% para 90%. Isso inicia a lavagem da coluna de HPLC.
- Para lavar ainda mais a coluna de HPLC, mantenha o nível do solvente B a 90% entre 16 e 18 min antes de reduzir gradualmente o nível do solvente B novamente para 10% entre 18 min e 19 min.
- Reequilibre a coluna de HPLC para as condições iniciais de 10% B entre 19 e 24 min.
- Injetar 50 μL de amostra no sistema de HPLC.
- Monitore os eluentes usando os comprimentos de onda de excitação/emissão do detector de fluorescência de 373/448 nm, e os ácidos siálicos derivatizados podem ser esperados nos tempos de retenção aproximados de 9 min (para Neu5Gc-OPD) e 10 min (para Neu5Ac-OPD).
- Calcule a quantidade relativa de Neu5Gc (FNeu5Gc) a partir das áreas de pico de fluorescência do Neu5Ac (ANeu5Ac) e Neu5Gc (ANeu5Gc) da seguinte forma:
FNeu5Gc [%] = 100×ANeu5Gc/(ANeu5Ac+ANeu5Gc). No caso das amostras de leite e fígado do camundongo homozigoto knock-out Cmah FNeu5Gc deve ser 0%, enquanto os valores para FNeu5Gc de camundongos heterozigotos e selvagens podem variar amplamente dependendo da idade do camundongo e do tipo de tecido (entre 2% e >90%) com margens de erro esperadas de ±12%.