Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Medindo o volume embrionário usando deslocamento de água
NOTA: Neste protocolo, são utilizados embriões pós-fertilização (hpf) de 24 h (Figura 1). Os embriões utilizados nas medições de volume não são utilizados na análise de etanol.
- Coloque 10 embriões e fluido extraembrionário em tubo de microcentrífuga de 1,5 mL marcado com um volume de 250 μL (Figura 2A). Adicione água à linha de enchimento de 250 μL (veja sample com água tingida na Figura 2B).
- Repita a etapa 1.1 para configurar receptáculos para embriões que tiveram seus córions removidos.
- Para remover o córion, coloque os embriões em seus córions em uma placa de Petri de 100 mm com 2 mg/mL de coquetel de protease em meio embrionário em temperatura ambiente (RT) por 10 min. A cada poucos minutos, gire suavemente os embriões para quebrar o córion.
- Quando todos os embriões estiverem livres de seu córion, remova os embriões descorionados do coquetel de protease/meio embrionário e coloque em uma nova placa de Petri de 100 mm com meio embrionário fresco para lavar os embriões. Repita esta etapa de lavagem mais 1 vez (para um total de 2 lavagens). Transferir os embriões para uma nova placa de Petri de 100 mm.
- Usando a menor ponta possível e sem danificar os embriões, remova cuidadosamente todo o líquido ao redor dos embriões usando um micropipetador p200 (Figura 2C) e pese a água com uma balança com precisão de <0,1 mg. Para determinar o volume da amostra de 10 embriões, subtraia o peso/volume da água (1 mL de água = 1 g de água) retirada de 250 μL. Para determinar o volume de um único embrião, divida a diferença entre 250 μL e o peso da água retirada por 10,
2. Tratamento de embriões com etanol
- Recolher os embriões dos tanques de acasalamento e colocá-los numa placa de Petri padrão de 100 mm. Não contar mais de 100 embriões por placa de Petri e incubar a 28,5 °C.
nota: Se o córion for removido (etapa 1.2), ele precisa ser removido antes de adicionar etanol.
- A 6 hpf, adicione até 100 embriões a uma nova placa de Petri padrão de 100 mm com meio embrionário ou meio embrionário + etanol a 1% (v/v). Cubra, mas NÃO sele a placa de Petri. Coloque os embriões em uma incubadora de baixa temperatura ajustada a 28,5 ° C por 18 h ou até que os embriões atinjam o ponto de tempo de desenvolvimento de 24 hpf.
3. Preparando o fluxo de trabalho antes de processar os embriões para cromatografia gasosa no espaço da cabeça
- Faça uma solução de 5 M NaCl em água (serão necessários 450 μL por tubo de amostra) para desnaturar todas as proteínas e prevenir o metabolismo do etanol. Fazer o cocktail de protease a uma concentração de 2 mg/ml em meio embrionário.
- Rotule um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e um frasco para cromatógrafo de gás de 2 mL para cada amostra. Rotule frascos adicionais de cromatógrafo a gás de 2 mL para os padrões de etanol descritos abaixo, bem como ar, água e os brancos de coquetel de NaCl/protease 5 M.
- Configure três micropipetadores p200, dois ajustados para 50 μL e o terceiro definido para 200 μL; um micropipetador p1000 ajustado para 450 μL e um micropipetador p2 ajustado para 2 μL. Para as pipetas de vidro usadas para transferir embriões das placas de Petri para os tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, passe rapidamente a ponta da pipeta por uma chama para alisar as bordas para não danificar os embriões ao puxá-los para a pipeta.
4. Processamento de embriões para cromatografia gasosa no espaço da cabeça
NOTA: Tanto os embriões em seus córions quanto aqueles previamente removidos de seus córions são tratados da mesma forma para consistência no cálculo dos fatores de diluição.
- Usando os dois micropipetadores p200 ajustados para 50 μL, desenhe 50 μL da solução de coquetel de protease em um e retire 50 μL de água no segundo.
- Usando a pipeta de vidro e o micropipetador, coloque rapidamente 10 embriões (da etapa 2.2) em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e feche a tampa (conforme descrito na Figura 2A). Repita para todas as amostras a serem testadas, controles e embriões tratados com etanol.
- Usando o micropipetador p200 ajustado para 200 μL, abra rapidamente a tampa e remova todos os meios embrionários residuais (conforme descrito na Figura 2C). Coloque rapidamente a pipeta contendo 50 μL de água no tubo e adicione rapidamente, mas suavemente (para não danificar os embriões) e remova a água. Adicione rapidamente 50 μL da solução de coquetel de protease do pipetador em espera e feche a tampa do tubo (Figura 2D).
nota: Execute esse processo uma amostra de cada vez.
- Deixe a amostra descansar em RT por 10 min para permitir que o coquetel de protease degrade o córion. Em seguida, adicione rapidamente 450 μL de NaCl 5 M e feche a tampa do tubo (Figura 2E). Vortex as amostras por 10 min. Para acelerar o processo, configure o misturador para vórtice de várias amostras ao mesmo tempo.
NOTA: Adicione uma pequena quantidade (~ 100 μL) de uma mistura de esferas de sílica (2 tamanhos, esferas de 0,5 mm e 1 mm) a qualquer tubo com embriões com mais de 24 hpf. Em embriões mais velhos, a notocorda permanecerá intacta, independentemente de quanto tempo eles são homogeneizados.
- Após homogeneizar por 10 min, remova rapidamente 2 μL de sobrenadante embrionário homogeneizado e adicione a um frasco de cromatógrafo gasoso. Feche rapidamente o frasco para injetáveis com a tampa de politetrafluoretileno.
5. Preparação de padrões de mídia e etanol
- Para preparar os padrões de mídia, diluir a mídia por um fator de 10 com uma solução de coquetel de NaCl / protease 5 M. Adicione 2 μL de cada amostra a um frasco para cromatógrafo gasoso e feche com uma tampa de politetrafluoretileno.
- Para preparar os padrões de etanol, crie uma diluição em série de etanol 100% em solução de coquetel de NaCl/protease 5 M para as seguintes concentrações: 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 e 40 mM. Adicione 2 μL de cada padrão a um frasco para cromatógrafo gasoso e sele com uma tampa de politetrafluoretileno.
6. Preparação da cromatografia em fase gasosa do espaço da cabeça
NOTA: A cromatografia gasosa do espaço da cabeça é usada para quantificar os níveis de etanol, não para separação.
- Defina o aquecedor do amostrador automático para 58 °C e ligue. Deixe o aquecedor atingir 58 °C e ligue as linhas de ar e gás hidrogênio que alimentam o cromatógrafo de gás (para ionização de chama usada para quantificar o etanol).
NOTA: O psi deve ser configurado para operar corretamente o cromatógrafo de acordo com as especificações do fabricante. Certifique-se de que a linha de hélio esteja ligada e ajustada para o psi adequado.
- Para o septo, certifique-se de que o número de amostras injetadas não seja >100. Para a fibra de injeção, certifique-se de que o número de amostras injetadas não seja >500.
NOTA: Se qualquer um deles estiver acima da quantidade de injeções, elas precisarão ser trocadas antes de executar as amostras de teste.
- Ligue o software de análise e certifique-se de que a estação de trabalho esteja configurada corretamente. Armazene todos os dados de acordo com os padrões do laboratório/departamento. Crie uma nova lista de exemplos para os exemplos a serem executados.
- Inicie o método de inicialização e aguarde até que o detector de ionização de chama se estabilize antes de executar as amostras. Uma vez estável, execute o método de inicialização do software para limpar a fibra.
7. Medições de amostras por cromatografia gasosa no espaço da cabeça
- Quando o método de inicialização estiver concluído, crie 1 nova linha por exemplo na lista de exemplos. No menu de métodos no software de análise, carregue 436 Atual spme etanol 2013 3min absorva 2_5min rg run. METH para cada amostra na lista de amostras.
- Preencha a lista de amostras, começando com o ar, água, 5 M NaCl / protease Em seguida, insira os padrões em ordem, de 0,3125 a 40 mM. Siga os padrões com uma segunda rodada de ar, água e 5 M NaCl / protease em branco do coquetel.
- Insira todas as amostras de sobrenadante de embriões homogeneizados a serem testadas, da menor para a maior concentração de etanol prevista. Termine entrando em uma terceira e última rodada de ar, água e 5 M NaCl / protease em branco do coquetel.
- Adicione os frascos para injetáveis do cromatógrafo de fase gasosa ao amostrador automático pela ordem em que as amostras foram introduzidas. Deixe as amostras aquecerem por 10 a 15 min. Inicie as execuções de amostra no software.
- Depois que todas as amostras e os espaços em branco finais forem executados, ative o método de desligamento no software adicionando uma amostra final na lista de amostras e executando o modo de espera. metanfetamina. Faça backup de todos os dados adquiridos durante as execuções de amostra. Desligue o equipamento na seguinte ordem: aquecedor do amostrador automático, tanque de hidrogênio e, somente após a temperatura do cromatógrafo atingir 30 °C, o tanque de ar. Deixe o tanque de hélio ligado para preservar a coluna de cera.
8. Integração de pico de etanol de amostra e análise de concentração de amostra
NOTA: Todos os valores a partir de 8.3 foram calculados em um arquivo excel que todas as equações pré-preenchidas.
- Quando o método de desligamento estiver concluído, clique em Abrir cromatograma. Abra a pasta que contém os resultados. As amostras são integradas automaticamente neste programa.
- Nos resultados, certifique-se de que os picos corretos foram integrados (picos de etanol entre 2 e 2,5). Depois que todas as amostras forem confirmadas, imprima ou exporte os resultados.
- Plote a altura do pico dos padrões de etanol em um gráfico. Calcular os valores de inclinação, intercepto Y e R2 para os padrões de etanol (R2 deve ser >0,99).
nota: Esses valores serão usados para determinar a concentração de etanol a partir da altura do pico da amostra.
- Para cada amostra, subtrair a altura do pico da amostra da intercepção Y dos padrões de etanol. Divida esse valor pela inclinação dos padrões de etanol para obter o valor de etanol para cada amostra nos frascos de GC.
- Para calcular a concentração de etanol nos embriões, calcule primeiro o fator de diluição para cada amostra. Pegue a medida de volume calculada na etapa 1.3 deste protocolo e divida-a pela medida de volume mais 500 μL. Isso representa a solução de coquetel de NaCl/protease 5 M adicionada a cada amostra durante o processamento do embrião (etapas 4.3 e 4.4).
- Utilizando este factor de diluição da amostra, multiplicar pelo valor do etanol da amostra para cada amostra. Os resultados serão em concentração de mM. Calcular as amostras de referência do meio multiplicando o valor do etanol do meio pelo factor de diluição de 10,
