1. Preparação de tampões e soluções
NOTA: Todos os buffers e soluções usados no protocolo estão resumidos na Tabela 1. Os volumes fornecidos dos buffers são suficientes para preparar e executar 10 amostras. Todos os tampões podem ser armazenados a +4 °C por até um ano.
- Prepare 20 mL de tampão de gel 3x contendo ácido aminocapróico 1,5 M, Bis-tris 150 mM em água destilada (dH2O). Ajuste o pH para 7,0.
- Preparar 10 ml de ácido aminocapróico 2 M em dH2O.
- Prepare 1 mL do tampão mitocondrial combinando o seguinte: 0,5 mL de tampão de gel 3x, 0,5 mL de ácido aminocapróico 2 M e 4 μL de EDTA 500 mM.
- Prepare 1.000 mL de tampão catódico contendo 15 mM de Bis-tris e 50 mM de tricina em dH2O. Ajuste o pH para 7,0.
- Prepare 200 mL de tampão catódico azul adicionando 0,04 g de azul de Coomassie G-250 a 200 mL de tampão catódico.
- Prepare 1.000 mL de tampão anódico contendo 50 mM de Bis-tris em dH2O. Ajuste o pH para 7,0.
- Prepare 2,5 mL de tampão de amostra contendo 750 mM de ácido aminocapróico e 5% de azul de Coomassie G-250 em dH2O.
2. Preparação de lisados mitocondriais
- Plaquear as células no dia anterior à coleta. Para células HEK293 ou 143B, use o meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino, 1% de L-glutamina, 100 mg/mL de penicilina e 100 mg/mL de estreptomicina. Cultive as células em uma incubadora de cultura de células a +37 °C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2. Certifique-se de que haja pelo menos 500.000 células para cada amostra no dia da coleta.
- Lave suavemente as células uma vez com PBS gelado. Evite separar as células da placa. Raspe as células e pegue-as a 800 x g por 10 min a +4 °C.
- Lave o pellet celular duas vezes com PBS gelado e centrifugue como na etapa 2.2. Meça a concentração de proteína com o método de Bradford usando um kit comercial. Pulverize as células a 800 x g por 10 min a +4 °C.
nota: Após a coleta da célula, execute todas as etapas a +4 °C e não faça vórtice.
- Prepare 20 mL de PBS com inibidor de protease adicionando 200 μL de inibidor de protease 100x a 20 mL de PBS. Mantenha no gelo. Ressuspenda as células em PBS com inibidor de protease até uma concentração final de proteína de 5 mg / mL.
- Para calcular o volume de PBS com inibidor de protease necessário para ressuspender as células a 5 mg / mL, calcule a quantidade de proteína em cada amostra. Para este cálculo, utilizar a concentração de proteínas medida no passo 2.3 e o volume de PBS utilizado para ressuspender as células após a lavagem no passo 2.3.
- Prepare 1 mL de digitonina 3,3 mM em PBS com inibidor de protease. Adicionar 3,3 mM de digitonina a uma concentração final de 1,65 mM. Misture bem e incube no gelo por 5 min.
- Para preparar 1 mL de digitonina 3,3 mM em PBS com inibidor de protease, dissolva 4 mg de digitonina em 1 mL de PBS a 100 ° C até que nenhum precipitado seja visível e esfrie imediatamente no gelo. Adicionar 10 μL de inibidor de protease 100x a 1 mL de solução de digitonina.
nota: Use apenas uma solução nova de digitonin.
cuidado: A digitonina é tóxica! Use uma máscara facial, luvas e um jaleco.
- Adicione PBS com inibidor de proteinase (preparado na etapa 2.4) ao volume final de 1,5 mL. Centrifugue a 10.000 x g por 10 min a +4 °C. Remova o sobrenadante. Nesta etapa, as mitocôndrias são peletizadas.
- Ressuspenda o pellet mitocondrial no tampão mitocondrial. O volume do tampão mitocondrial é metade do volume de PBS na etapa 2.4.
- Prepare lauril maltosídeo fresco a 10% em PBS contendo inibidor de protease (preparado na etapa 2.4). 1 mL é suficiente para 10 amostras. Adicione 10% de lauril maltosídeo à concentração final de 1%. Incube no gelo por 15 min (esta etapa pode ser mais longa até algumas horas).
- Centrifugue a 20.000 x g durante 20 min a +4 °C. Recolher o sobrenadante para um novo tubo. Meça a concentração de proteínas pelo método de Bradford usando um kit. Adicione o tampão de amostra, um volume que é metade do volume de lauril maltosídeo usado na etapa 2.8. As amostras podem ser armazenadas a -80 °C por até 6 meses.
3. Preparação de gel gradiente para BN-PAGE
- Despeje o gel gradiente para BN-PAGE em temperatura ambiente. Coloque o gradiente em uma placa de agitação e conecte-o com um tubo flexível à bomba peristáltica. Conecte um conjunto de infusão com a agulha ao tubo. Coloque um agitador magnético na câmara proximal do fabricante de gradiente. Lave a tubulação com dH2O na velocidade máxima da bomba por 10 min.
- Esvazie a tubulação e o gradiente. Use uma pipeta para remover qualquer resíduo de dH2O no canal entre as câmaras do fabricante de gradiente. Feche o canal e a tubulação com a válvula.
- Usando a estrutura de fundição e os grampos, monte duas placas de vidro no suporte, que tem um orifício na parte inferior, e coloque-o no suporte. Certifique-se de que está mais ou menos em uma superfície reta com equilíbrio hídrico. Coloque a agulha conectada ao tubo entre as placas de vidro.
- Prepare soluções em gel a 6% e 15% (Tabela 2). Mantenha no gelo. Adicione o persulfato de amônio (APS) e a tremetilenodiamina (TEMED) (eles iniciam a polimerização) por último. Misture delicadamente para evitar bolhas de ar.
- Carregue a extremidade proximal da câmara de tubulação gradiente-gel-misturador com gel a 6% e a extremidade distal com gel a 15%. O volume total do gel deve ser igual ao volume do gel de separação entre as placas de vidro. Assim, use 2,6 mL de gel a 6% e 2,1 mL de gel a 15% no misturador de gel gradiente para um gel de 8,3 cm x 7,3 cm.
- Ligue o agitador magnético e abra a tubulação e o canal entre as câmaras do fabricante de gradiente. Ligue imediatamente a bomba peristáltica para 5 mL/min. Encha as placas de vidro e não permita que bolhas entrem no gel. Remova a agulha quando não houver gel no tubo.
- Cubra suavemente o gel com dH2O. Mantenha o gel em temperatura ambiente por pelo menos 1 h para polimerização.
- Imediatamente após despejar o gel, lave o tubo enchendo as câmaras de gradiente com dH2O e usando a bomba peristáltica na velocidade máxima. Ao preparar dois ou mais géis, sempre limpe o sistema entre eles.
- Prepare 1x tampão de gel misturando 3 mL de 3x tampão de gel e adicione 6 mL de dH2O. Remova dH2O da superfície do gel com papel de filtro suavemente. Lave a superfície do gel com 1x tampão de gel. Remova 1x tampão de gel com papel de filtro suavemente.
- Evite fibras do papel de filtro no gel. Para garantir isso, corte o papel em pedaços pequenos com uma tesoura, mas não rasgue o papel.
- Coloque o pente entre as placas de vidro, mas não o mergulhe totalmente para poder derramar o gel de empilhamento sob o pente. Prepare o gel de empilhamento a 4% (Tabela 2). Adicione APS e TEMED por último, pois eles iniciam a polimerização facilmente. Misture delicadamente evitando bolhas de ar.
- Cubra o gel de empilhamento, evitando bolhas sob o pente, e mergulhe o pente completamente. Deixe o gel de empilhamento polimerizar por pelo menos 30 min. Retire o pente e lave os poços com 1x tampão de gel usando uma pipeta.
- Após a polimerização, o gel pode ser armazenado a +4 °C por alguns dias. Para armazenar o gel, embrulhe-o em papel embebido em dH2O e filme plástico para evitar o ressecamento do gel.
4. Eletroforese em gel nativo azul
NOTA: Para evitar a degradação dos complexos OXPHOS, execute a eletroforese a +4 °C. Use tampões pré-resfriados.
- Carregue o de gel com o tampão catódico azul até o fundo dos poços. O carregamento das amostras é mais fácil quando o não está cheio até o topo. Lave os poços com o tampão de cátodo azul e, em seguida, encha os poços com o tampão de cátodo azul usando pipeta.
- Carregue as amostras (5-30 μg de proteína) em poços. Encha suavemente o de gel até o topo com o tampão de cátodo azul e o tanque com tampão de ânodo.
- Execute o gel por 15 min a uma tensão constante de 40 V. Em seguida, aumente a tensão para 80 V (ou use uma corrente constante de 6 mA), não exceda 10 mA. Passe o gel até que o corante atinja 2/3 do comprimento do gel.
- Substitua o tampão catódico azul por tampão catódico e continue a eletroforese até que a frente do corante acabe. No total, a eletroforese leva cerca de 3 horas.
- Recupere as placas de vidro e transfira as proteínas para a membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) por semi-secagem.