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1. Funcionalização da matriz com o anticorpo biotinilado
- Prepare as seguintes soluções.
- Tampão T50, uma solução de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) e NaCl 50 mM. A solução é estável por 1 mês em RT.
- T50-BSA suplementando o tampão T50 com 0,1 mg/mL de BSA. Mantenha a solução preparada no gelo.
- 10 mg/mL de borohidreto de sódio (NaBH4) em 1x PBS. Prepare-o imediatamente antes de usar.
- 0,2 mg/mL de NeutrAvidina (ver Tabela de Materiais) em tampão T50.
cuidado: O NaBH4 é um agente redutor e inflamável. Sempre purgue o recipiente com gás nitrogênio após o uso e armazene-o em um dessecador.
- Funcionalize a matriz com o anticorpo biotinilado.
- Remova as matrizes funcionalizadas de PEG-biotina do freezer e equilibre o tubo cônico com RT antes de abrir. Coloque a lamínula com a matriz voltada para cima em um prato de cultura de tecidos de 100 mm (TC100) revestido com filme de vedação.
nota: Minimize a iluminação do teto. Todas as soluções devem "se encaixar" nos quadrados definidos pela matriz hidrofóbica. Adicione um volume apropriado de solução para cobrir completamente cada quadrado (normalmente 10-15 μL) e não permita que o líquido transborde do espaço definido. Para remover líquidos rapidamente, use uma linha de vácuo interna conectada a um frasco de vácuo para capturar os resíduos. Deixe o NaBH4 desgaseificar por 1 h antes do descarte, deixando o tubo aberto na capela de exaustão química. O tratamento com NaBH4 é necessário para reduzir a autofluorescência de fundo, reduzindo assim as detecções de molécula única falso-positivas.
- Trate cada quadrado da matriz com 10 mg / mL de NaBH4 em 1x PBS por 4 min em RT. Lave três vezes com PBS.
- Incubar cada quadrado por 5 min com 0,2 mg/mL de NeutrAvidina em T50. Lave três vezes com T50-BSA.
nota: A NeutrAvidina se liga à PEG-biotina e fornece um local de ligação para anticorpos biotinilados.
- Incubar cada quadrado por 10 min com 2 μg/mL de anticorpo específico para POI biotinilado em T50-BSA; lavar três vezes com T50-BSA.
nota: O presente protocolo usa IgG anti-EGFR biotinilada (ver Tabela de Materiais) para capturar EGFR-GFP.
2. SiMPull de POI de lisados de células inteiras
NOTA: Coloque o prato TC100 de matrizes SiMPull funcionalizadas no gelo pelo restante da preparação do SiMPull. Esta etapa é a retirada de um POI do lisado de proteína total. O lisado não deve ser reutilizado após o descongelamento.
- Prepare as seguintes soluções.
- Prepare paraformaldeído (PFA) a 4% / glutaraldeído (GA) a 0,1% em 1x PBS.
cuidado: PFA e GA são fixadores químicos tóxicos e potencialmente cancerígenos. Use EPI. Descarte os produtos químicos como resíduos perigosos de acordo com os regulamentos e diretrizes locais.
- Prepare 10 mM Tris-HCl, pH 7,4.
- Descongele e misture o lisado pipetando suavemente para cima e para baixo. Mantenha no gelo.
- Diluir 1 μL do lisado em 100 μL de T50-BSA/PPI.
gelados
nota: Se necessário, determinar o factor de diluição adequado do lisado de proteínas totais, aplicando uma gama de diluições à matriz. A densidade ideal de receptores SiMPull por área de matriz é de 0,04-0,08 / μm2.
- Incubar o lisado na matriz por 10 min; em seguida, lave quatro vezes com T50-BSA/PPI gelado.
- Dilua o anticorpo antifosfotirosina conjugado com AF647 (consulte a Tabela de Materiais) em T50-BSA/PPI gelado e incube na matriz por 1 h.
nota: No presente protocolo, um pan anti-pTyr (PY99)-AF647 IgG é usado para identificar a população fosforilada de EGFR-GFP. O uso de anticorpos marcados diretamente elimina a necessidade de anticorpos secundários, aumentando as opções de marcação e melhorando a consistência dos resultados. Anticorpos marcados com fluorescência podem ser obtidos de fontes comerciais. Se não estiverem disponíveis comercialmente, os anticorpos podem ser rotulados de forma personalizada usando técnicas de bioconjugação padrão e kits de bioconjugação comerciais estão disponíveis. Cada lote de anticorpos marcados com fluorescência precisa ser testado para condições ideais de marcação, realizando SiMPull para medir uma curva de dose e encontrar o ponto de saturação.
- Lave seis vezes com T50-BSA gelado por um total de 6-8 min.
- Lave duas vezes com 1x PBS gelado.
- Incube a matriz com solução de PFA a 4% / GA a 0,1% por 10 min para evitar a dissociação de anticorpos.
- Lave duas vezes por 5 min cada com Tris-HCl 10 mM, pH 7,4/PBS para inativar os fixadores.
nota: Para experimentos usando mais de um anticorpo (por exemplo, detecção de vários locais de fosfotirosina), repita as etapas 2.5-2.9.
3. Aquisição de imagens
NOTA: A aquisição de imagem de molécula única é realizada usando uma objetiva TIRF de 150x e um divisor de imagem que captura cada canal espectral em um quadrante específico da câmera emCCD (consulte a Tabela de Materiais). As imagens de calibração são adquiridas primeiro para permitir o registro do canal e a calibração do ganho da câmera com uma grade de alinhamento de canal nanopadronizada (nanogrid) que contém 20 x 20 matrizes de orifícios de 200 ± 50 nm a uma distância intrafuro de 3 ± 1 μm (tamanho total ~ 60 μm × 60 μm).
- Realize o cadastro do canal seguindo os passos abaixo.
nota: O registro preciso do canal é necessário para calcular corretamente a colocalização dos emissores. Esta etapa é crítica.
- Limpe a objetiva de óleo e deposite uma gota de óleo na objetiva. Coloque a nanorrede no palco para a geração de imagens. Usando luz branca transmitida, concentre-se no padrão de grade.
nota: As imagens com a nanorrede são adquiridas usando luz transmitida, que passa pela nanorrede e é detectada em todos os canais espectrais. Alternativamente, pode-se usar esferas multifluorescentes que emitem fluorescência detectada em cada canal. A aquisição de imagens precisará ser otimizada de acordo com cada configuração do microscópio.
- Adquira uma série de 20 imagens da grade. Certifique-se de que os pixels não estejam saturados. Salve a série de imagens como "Fiducial".
- Desfoque a nanorrede para criar um padrão arejado. Adquira uma série de 20 imagens para calibrações de ganho. Salve a imagem como "Ganho".
- Adquira uma série de 20 imagens para deslocamento da câmera, bloqueando toda a luz de ir para a câmera. Salve a imagem como "Plano de fundo".
- Adquira imagens SiMPull.
nota: Antes de obter imagens da matriz de lamínula, troque a solução Tris por T50-BSA e equilibre a matriz com RT.
- Limpe a objetiva de óleo e deposite óleo adicional na objetiva. Prenda a matriz de lamínula na platina do microscópio.
- Otimize o poder de excitação de cada fluoróforo, o ângulo TIRF e o tempo de integração da câmera. O objetivo é obter a mais alta relação sinal-ruído, minimizando o fotobranqueamento da amostra. Registre a potência do laser para consistência em medições futuras.
nota: O presente estudo utilizou o tempo de exposição de 300 ms para o canal vermelho distante e 1 s para o canal verde. O laser de 642 nm foi usado com aproximadamente 500 μW de potência do laser, enquanto o laser de 488 nm foi usado com 860 μW, medido antes da lente do tubo.
- Adquira imagens para cada amostra. Visualize primeiro o canal vermelho distante, seguido por cada fluoróforo de comprimento de onda mais baixo para reduzir o fotobranqueamento. Devido ao baixo volume usado para cada amostra, verifique o nível do tampão a cada 30-45 min e reabasteça conforme necessário.