$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Bicamadas lipídicas planares
- Limpeza a plasma das lâminas
nota: A limpeza por plasma remove contaminantes orgânicos e aumenta a hidrofilicidade do vidro, garantindo uma adsorção lipídica eficiente. As etapas a seguir podem mudar ou precisar ser otimizadas dependendo do limpador de plasma e das lamínulas de vidro usadas.
- Purgue o limpador de plasma por 5 min com oxigênio para remover o ar das linhas e da câmara. Isso é para garantir que, quando o limpador de plasma for executado, haja principalmente oxigênio nas linhas e na câmara, proporcionando preparações de bicamada mais consistentes.
- Durante a purga, passe um gás inerte, como N2 ou Ar, sobre as microlâminas de vidro de cobertura para remover poeira e partículas.
opcional: As lâminas de vidro de cobertura podem ser lavadas pulverizando cada lado com isopropanol 100% seguido de água. Repita a lavagem com água de isopropanol 3x e depois seque com um jato de N2.
- Disponha as lâminas de vidro de cobertura secas em um berço de cerâmica. Coloque o berço na parte de trás da câmara de plasma de modo que as lamínulas fiquem paralelas à borda longa da câmara (isso as mantém no lugar durante a limpeza do plasma). Execute o limpador de plasma por 15 min com oxigênio na potência máxima.
- Preparação da Câmara
nota: O método descrito aqui usa câmaras caseiras de tubos de PCR de plástico para suportar os volumes de reação, mas outros materiais de baixa adesão, como poços de silicone, também podem ser adequados.
- Usando uma lâmina de barbear ou tesoura, corte a tampa logo abaixo da parte fosca de um tubo de PCR de 0,2 mL (Figura 1).
- Pinte a borda do tubo de PCR com adesivo ativado por UV, evitando o interior do tubo. Coloque suavemente a cola do tubo de PCR no centro de uma lamínula limpa por plasma.
nota: Para evitar cola dentro da câmara, use a quantidade mínima de cola para obter uma vedação e trate imediatamente com UV sem bater ou perturbar a câmara.
- Coloque a câmara sob luz UV de comprimento de onda longo por 5-7 min para curar o adesivo.
- Formação de Bicamada
nota: SUVs monodispersos devem ser usados nesta etapa para a formação eficiente de bicamada. A Tabela 1 fornece receitas para todos os tampões usados na formação da bicamada, incluindo as concentrações de estoque e tampão final.
- Adicione 40 μL de tampão de bicamada lipídica suportado (SLBB: 300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM MgCl2; Tabela 1), 10 μL de SUVs de 5 mM e 1 μL de CaCl100 mM 2 para o poço. Agite suavemente as câmaras de um lado para o outro para interromper os SUVs e, em seguida, incube a 37 °C por 20 min.
nota: Para limitar a evaporação, incube em uma placa de Petri coberta com um lenço umedecido.
- Lavar o excesso de lipídios
nota: Esta etapa remove o excesso de SUVs e atua como uma etapa de troca de buffer. É muito importante não raspar a bicamada com a ponta da pipeta durante a lavagem; Se o vidro for exposto, as septinas e muitas outras proteínas se ligarão irreversivelmente, reduzindo a concentração efetiva de proteínas.
- Após a incubação, enxágue a bicamada 6x com 150 μL de SLBB, pipetando para cima e para baixo para misturar a cada vez, evitando bolhas.
NOTA: Adicione 150 μL diretamente aos 50 μL de tampão e SUVs já presentes para um total de 200 μL no poço de reação.
- Quando estiver pronto para iniciar a incubação com as septinas ou uma proteína diferente de sua escolha, lave a bicamada 6x com 150 μL de tampão de reação (RXN: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1,4 mg/mL BSA, 0,14% de metilcelulose, 1 mM de BME).
NOTA: Para obter melhores resultados, torne o tampão de reação fresco e tenha muito cuidado ao misturar bem a reação para evitar bolhas.
- Na última etapa de lavagem, remova 125 μL de tampão de reação, deixando 75 μL no poço. Adicionar 25 μL de septinas diluídas em tampão de armazenamento de septinas (SSB: 300 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM BME) na concentração desejada e imagem por microscopia TIRF.
nota: Ao configurar este ensaio pela primeira vez ou incorporar uma nova composição lipídica, é uma boa prática garantir que os lipídios se difundam livremente na superfície usando a recuperação de fluorescência após o fotobranqueamento (FRAP). Embora a taxa de recuperação seja diferente para diferentes composições lipídicas e inerentemente menor do que para sistemas independentes, os lipídios não devem ser imóveis.
Tabela 1: Componentes tampão para preparação de bicamada lipídica suportada e reações. São apresentados os volumes de soluções de reserva que são incorporados nos tampões e as concentrações finais de cada componente. SLB e PRB podem ser armazenados em temperatura ambiente e reutilizados entre os experimentos. O tampão de reação e o SSB são feitos frescos para cada experimento.
| Tampão de bicamada lipídica suportado (SLBB) |
| estoque | volume | Concentração final |
| 2 M KCl | 1,5 mL | 300 mM |
| 1 M HEPES | 200 μL | 20 mM |
| 500 mM MgCl2 | 20 μL | 1 mM |
| Água | 8 mL | |
| Tampão de pré-reação (PRB) |
| estoque | volume | Concentração final |
| 2 M KCl | 166 μL | 33,3 mM |
| 1 M HEPES | 500 μL | 50 mM |
| Água | 9,33 ml | |
| Buffer de reação |
| estoque | volume | Concentração final |
| 2 M KCl | 166 μL | 33,3 mM |
| 1 M HEPES | 300 μL | 50 mM |
| 10 mg/mL BSA | 1,39 mL | 1,39 mg/ml |
| 1% de metilcelulose | 1,39 mL | 0,0014 |
| Água | Até 10 mL | |
| Bme | 0,7 μL | 1 mM |
| Buffer de armazenamento de septina (SSB) |
| estoque | volume | Concentração final |
| 2 M KCl | 1,5 mL | 300 mM |
| 1 M HEPES | 500 μL | 50 mM |
| Água | Até 10 mL | |
| Bme | 0,7 μL | 1 mM |
