Ensaio de Bicamada Lipídica Esférica Suportada: Uma Técnica para Observar a Montagem de Septina em Microesferas

Resumo

Fonte: Curtis, B. N. et al., Reconstituição da Montagem de Septina em Membranas para Estudar Propriedades e Funções Biofísicas. J. Vis. Exp. (2022).

Este vídeo descreve a técnica de estudo da montagem da proteína septina em microesferas revestidas com bicamadas lipídicas. Essa técnica ajuda a entender os conjuntos de proteínas dependentes da curvatura em superfícies curvas.

Protocolo

1. Bicamadas lipídicas esféricas suportadas

NOTA: Este protocolo usa microesferas de sílica suspensas em água ultrapura a 10% de densidade. Para qualquer trabalho sobre os parâmetros cinéticos da montagem de proteínas, é importante controlar rigorosamente a área total da superfície da membrana entre experimentos e curvaturas. A Tabela 1 mostra os volumes corrigidos de grânulos e tampão para manter 5 mm² de área total da superfície da membrana.

1. Formação de bicamada
   nota: Quanto às bicamadas planas, é importante ter SUVs de alta qualidade para a formação robusta de bicam. A Tabela 1 lista o volume de grânulos de uma solução de densidade a 10% e seus respectivos volumes de SLBB que são usados para obter uma área de superfície final de 5 mm² para uma variedade de diâmetros de cordão.
   1. As microesferas de sílica (também chamadas de contas) tendem a se estabelecer e se aglomerar; para misturar as esferas e quebrar quaisquer aglomerados, faça um vórtice na garrafa por 15 s, depois bata-sonicate por 1 min e vórtice novamente por 15 s.
   2. Misture o volume apropriado de grânulos (Tabela 1) com o volume correspondente de SLBB e 10 μL de SUVs de 5 mM em um tubo de microcentrífuga de baixa adesão de 0,5 mL.
   3. Agite a mistura de grânulos e lipídios de ponta a ponta por 1 h em temperatura ambiente. Certifique-se de que esta incubação seja feita em um rotador para evitar sedimentação.
2. Prepare as câmaras em lamínulas PEGiladas
   nota: Quanto às bicamadas planares, câmaras caseiras de tubos de PCR de plástico são usadas para suportar os volumes de reação, mas outros materiais de baixa adesão, como poços de silicone, também podem funcionar.
   1. Enquanto as contas estão balançando, descongele uma lamínula PEGulada em temperatura ambiente. Corte um tubo de PCR de 0,2 mL e cole-o na lamínula conforme descrito. Para lâminas de 24 mm x 50 mm, até 10 câmaras podem caber em uma lâmina.
      nota: Este protocolo usa lamínulas de vidro PEGulado de 24 mm x 50 mm que são preparadas com antecedência. Resumidamente, as lamínulas de vidro são completamente limpas por meio de sonicação em acetona, metanol e 3 M KOH. As lamínulas são então funcionalizadas com n-2-aminoetil-3-aminopropiltrimetoxissilano e covalentemente ligadas ao valerato de succinimidil mPEG. As lamínulas PEGuladas acabadas são armazenadas seladas a vácuo a -80 °C. Embora as lamínulas de vidro PEGuladas sejam sugeridas aqui, outros meios de passivação, como os métodos BSA ou poli-L-lisina, podem ser eficazes.
3. Lavando o excesso de lipídios
   nota: Esta etapa funciona para remover o excesso de SUVs e realizar uma troca de buffer. Os grânulos são lavados 4x no total com tampão pré-reação (PRB: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4). A Tabela 2 lista as velocidades de centrifugação em RCF para uma variedade de diâmetros de cordão.
   1. Gire os grânulos no RCF designado por 30 s (Tabela 2). Se estiver usando vários tamanhos de contas, mantenha as contas balançando até a hora de serem lavadas.
      nota: Não vale a pena sedimentar grânulos maiores no mesmo spin que grânulos menores com a velocidade de sedimentação do grânulo menor para economizar tempo. Isso pode fazer com que as contas grudem umas nas outras e comprometam a integridade da bicamada.
   2. Após a primeira centrifugação, remova 50 μL de sobrenadante e adicione 200 μL de PRB. Após a segunda e terceira centrifugação, remova 200 μL e adicione 200 μL de PRB. Após a quarta centrifugação, remova 200 μL e adicione 220 μL de PRB. Pipetar vigorosamente para cada lavagem.
      nota: O volume final de ressuspensão é diferente das lavagens. Não vortex as contas após a incubação com os lipídios, pois isso pode deixar lacunas nas bicamadas. Para evitar a sedimentação ao trabalhar com os outros tamanhos de grânulos ou configurar outras partes do ensaio, coloque as misturas de grânulos de volta no rotador de ponta a ponta.
4. Preparando a reação
   1. Se estiver fazendo um ensaio de competição com vários tamanhos de cordão, faça uma mistura 1:1 misturando volumes iguais de cada tamanho de cordão. Em seguida, misture 29 μL da mistura de grânulos desejada (ou de um único cordão) com 721 μL de tampão RXN.
      nota: É importante misturar bem as contas em cada etapa com uma pipeta para evitar aglomerados densos de contas; Isso resultará em uma distribuição de grânulos mais uniforme e área de superfície total precisa.
   2. Misture 75 μL de grânulos diluídos e 25 μL de proteína diluída em SSB nos poços.
      nota: Os autores normalmente visualizam complexos de septina de levedura a 1-50 nM.
   3. Se estiver medindo septinas em estado estacionário, incube em temperatura ambiente por 1 h e, em seguida, faça a imagem por microscopia próxima ao TIRF ou confocal.
      nota: Esta reação é projetada para preservar a área total da superfície da membrana da reação em 5 mm² e produzir uma condição de reação final de 100 mM KCl, 50 mM HEPES, 1 mg / mL BSA, 0,1% de metilcelulose e 1 mM BME.

Tabela 1: Volumes normalizados de microesferas. Para manter uma área de superfície igual de cada tamanho de cordão e manter a área de superfície total da membrana consistente entre os experimentos, foram calculados volumes para cada tamanho de cordão e tampão que normalizaram a área de superfície total.

Diâmetro do grânulo (μm)	Volume de grânulos bem misturados (μL)	Volume de tampão SLB (μL)	Volume de SUVs (μL)
6.46	8,94	61.1	10
5.06	7	63	10
3.17	4.39	65.6	10
0,96	1,33	68.7	10
0,54	0,75	69,3	10
0,31	0,43	69.6	10

Tabela 2: Velocidades de sedimentação para microesferas de diâmetros variados. Para cada diâmetro de cordão, as velocidades mínimas de sedimentação mostradas foram usadas para peletar os grânulos para lavar os lipossomas não ligados

Diâmetro do cordão (μm)	Velocidade de sedimentação (RCF)
0,31	4.5
0,54	4.5
0,96	2.3
3.17	0,8
5.06	0,3

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de PCR de 0,2 mL com tampa plana, Natural	Watson	137-211C (EX)
Tubos de baixa adesão de 0,5 mL	EUA Científico	1405-2600
Beta-mercaptoetanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A4612-25G
Lamínula para fazer lamínulas PEGuladas	Thermo Científico	Rolamento 152450	Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Tampa de Vidro 24x50 #1.5
DOPC	Lipídios Polares Avanti	850375
Ovo Liss Rodamina PE	Lipídios Polares Avanti	810146
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-1KG
Metilcelulose 4000cp	Sigma-Aldrich	M052-100G
Mini centrífuga
Microesferas de sílica não funcionalizadas	Laboratórios Bangs, Inc.	Depende do tamanho: SS0200 * -SS0500 *	Sílica em suspensão aquosa
Adesivo Óptico	Norland Thorlabs	NOA 68	Adesivo flexível para vidro ou plástico
Cloreto de potássio	VWR	0395-1kg
Banho Sonicator	Branson	1510R-MT	Limpador ultrassônico Bransonic. 50-60 Hz. Saída: 70W
PI de soja	Lipídios Polares Avanti	840044
Centrífuga de mesa	Eppendorf	22331
Lâmpada UV	Espectrolina	ENF-260C	115 Volts, 60 Hz, 0,20 AMPS