Ensaio alamarBlue: um método fluorométrico sensível para rastrear os efeitos citotóxicos de formulações de lágrimas artificiais na atividade metabólica de células epiteliais da córnea humana

Resumo

Fonte: Rangarajan, R. et al. Efeito das formulações de lágrimas artificiais na atividade metabólica das células epiteliais da córnea humana após a exposição à dessecação. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo descreve um ensaio fluorométrico in vitro para avaliar os efeitos de formulações de lágrimas artificiais na atividade metabólica celular de células epiteliais da córnea usando solução de azul de Alamar à base de resazurina. Uma formulação não tóxica mantém as células em um estado saudável e metabolicamente ativo, facilitando a redução da resazurina em uma resorufina altamente fluorescente.

Protocolo

1. Cultura de células epiteliais da córnea humana

1. Cultive HCEC imortalizado em frascos revestidos de colágeno de 75 cm² com 20 mL de meio Eagle modificado de Dulbecco/mistura de nutrientes F-12 (DMEM/F12) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina a 37 °C com 5% de CO₂,
   NOTA: Não é necessário agitar.
2. Mude a mídia a cada 2 a 3 dias.

2. Preparação das células para o ensaio

1. Depois que as células estiverem quase confluentes, remova os meios de cultura.
2. Adicionar 4−6 ml de solução de dissociação celular a cada balão de 75 cm². Incubar as células a 37 °C até que as células se desprendam (aproximadamente 20−30 min), verificando ao microscópio periodicamente.
3. Adicione 2−6 mL de DMEM/F12 contendo 10% de FBS a cada frasco de 75 cm².
4. Transferir o conteúdo do balão para um tubo de centrifugação de 50 ml.
5. Centrifugue as células a 450−500 x g por 5 min. Pipete o sobrenadante e ressuspenda as células em meio pré-aquecido.
6. Conte as células usando um hemocitômetro. Calcule o volume de mídia que contém um total de 1 x 10⁵ células.
7. Adicione 1 x 10⁵ células a cada poço de uma placa de cultura revestida com colágeno-1 de 48 poços. Adicione meios suficientes ao poço para que o volume final de meios no poço seja de 0,5 mL de cultura DMEM/F12 com 10% de FBS.
   NOTA: Uma formulação de lágrima artificial pode causar citotoxicidade que pode ser medida por uma diminuição na atividade metabólica do HCEC. A consistência dos dados depende da adição do mesmo número de HCEC a cada poço durante a semeadura. A concentração de cultura recomendada para placas de 48 poços é de 1 x 10⁵. Como as células de mamíferos podem se depositar no tubo de centrífuga após a ressuspensão, recomenda-se ressuspender as células por agitação com frequência enquanto semeia as placas com células, de modo que a suspensão celular tenha o HCEC igualmente distribuído.
8. Incubar as células a 37 °C e 5% de CO₂ durante 24 h.

3. Sem protocolo de dessecação

1. Procedimento de controlo
   1. Após 24 horas de incubação, retirar os meios de cultura da placa.
   2. Trate imediatamente com 150 μL de uma formulação de teste e solução de controle de meios.
   3. Incubar as células a 37 °C e 5% de CO₂ durante 30 min.
   4. Remova as soluções de teste das células.
   5. Adicione 0,5 mL de solução de corante metabólico a 10% para testar a atividade metabólica. Incubar as células por mais 4 h a 37 °C e 5% de CO₂.
   6. Após o período de incubação de 4 h, remova 100 μL de solução de corante metabólico de cada poço e coloque cada 100 μL em um poço de uma placa de 96 poços.
   7. Meça a fluorescência de cada poço usando um leitor de placas fluorescentes (Tabela de Materiais). Definir o comprimento de onda de excitação em 540 nm e o comprimento de onda de emissão em 590 nm.
2. Sem protocolo de dessecação (procedimento de recuperação)
   1. Repita as etapas 3.1.1 a 3.1.4.
   2. Adicione 0,5 mL de mídia DMEM/F12 a cada poço.
   3. Incubar um conjunto de culturas durante 18 h a 37 °C e 5% de CO₂.
   4. Remova o meio e adicione 0,5 mL de solução de corante metabólico a 10%. Repita as etapas 3.1.6 e 3.1.7.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de 96 poços	Costar	3370
alamarBlue	Fisher Científico	dal 1025
Placas de 48 poços de Corning	Corning	354505	Este é o colágeno da marca BioCoat revestido
DMEM/F12 com L-glutamina e HEPES 15 mM	Gibco	Rolamento 11039-021	Não há vermelho de fenol nesta mídia
Soro fetal bovino	Hicone	SH30396.03
Células epiteliais da córnea humana	Universidade de Ottawa	N/A	SV40 imortalizou células epiteliais da córnea humana do Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canadá) e foram caracterizadas Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Equivalentes funcionais da córnea humana construídos a partir de linhagens celulares. Ciência. 1999; 286:2169–72.
TrypLE Express (solução de dissociação celular)	Fisher Científico	12605036
Citação 5	BioTek	CYT5MPV	Pode ler fluorescência de 280 a 700 nm (para o ensaio 540/590)