Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Crescimento e preparação de inóculos bacterianos
- Descongelar as reservas de glicerol de Helicobacter pylori (H. pylori) ou H. felis a partir de -80 °C e subcultura em placas de ágar sangue de cavalo (HBA) compreendendo: Ágar Sangue Base N.º 2 (ver Tabela de Materiais); um "suplemento selectivo de antibióticos de Skirrow" modificado (constituído por vancomicina, 10 μg/ml; polimixina B, 25 ng/mL; trimetoprima, 5 μg/mL; anfotericina B, 2,5 μg/mL); e 5–10% (v/v) de sangue de cavalo. As bactérias crescem bem em condições microaeróbicas em frascos anaeróbicos de 2,5 ou 3,5 L contendo os pacotes de gás apropriados (ver Tabela de Materiais), a 37 °C.
NOTA: As cepas de H. pylori cultivadas nessas condições devem ser subcultivadas após 1–1,5 dias de incubação, enquanto para H. felis, geralmente são necessários pelo menos 2 dias de incubação. Os meios de cultura e armazenamento adequados foram descritos em detalhes anteriormente.
- Prepare inóculos bacterianos para infecção de camundongos a partir de culturas de fase logarítmica inicial a média. Colha as bactérias suavemente das placas de ágar, inundando cada placa com 1–2 mL de caldo de infusão cérebro-coração (BHI). Aspirar suspensões de placas com pipetas Pasteur.
- Alternativamente, prepare inóculos de bactérias Helicobacter que foram propagadas em caldo BHI por 16–18 h. Neste caso, colete bactérias por centrifugação de baixa velocidade a 2.200 x g por 10 min a 4 °C.
- Avalie a viabilidade e motilidade das bactérias examinando preparações de montagem úmida sob microscopia de contraste de fase (objetivo de 100X). Prepare montagens úmidas ressuspendendo um loop cheio de bactérias em uma gota de 10 a 20 μL de caldo BHI em uma lâmina de microscópio de vidro. No caso de H. felis, que é uma bactéria muito maior que H. pylori, use um hemocitômetro para contar com precisão o número de bactérias viáveis. Confirme a pureza da cultura realizando uma coloração de Gram.
nota: Use apenas inóculos de H. pylori se a maioria das bactérias tiver formato bacilar ou espiral (a morfologia pode variar dependendo da cepa). Os inóculos de H. felis devem conter principalmente bactérias em forma de hélice.Não use inóculos se a maioria das bactérias tiver uma morfologia cocóide, pois essas formas não são viáveis e não estabelecerão uma infecção em camundongos.
- Estimar o número de bactérias no inóculo contando, em microscopia de contraste de fase, o número aproximado de bactérias por campo (objetivo de 100X) e utilizando o seguinte guia: 1 bactéria por campo = aproximadamente 106 unidades formadoras de colónias (UFC) de Helicobacter/ml; 10 bactérias por campo = aproximadamente 107 UFC/ml; 100 bactérias por campo = aproximadamente 108 UFC/ml; etc.
- Ao usar um hemocitômetro, calcule UFC/mL usando a seguinte fórmula:
UFC/ml = (número médio de bactérias num campo 4 x 4) x (factor de diluição) x (104).
- Ajustar a densidade celular bacteriana do inóculo para aproximadamente 107–108 UFC/ml por diluição em caldo BHI, se necessário.
- Para garantir a máxima viabilidade bacteriana, use inóculos para gavagem intragástrica o mais rápido possível após a preparação.
- Sempre confirme a densidade e a viabilidade celular do H. pylori realizando a contagem viável de inóculos imediatamente após o procedimento de gavagem (veja abaixo). Isso nem sempre é possível para H. felis, pois geralmente não forma colônias isoladas em meios de cultura. O número de Helicobacters viáveis nos inóculos não pode ser determinado apenas pela medição da densidade óptica (A600), pois este método não discrimina entre bactérias viáveis (ou seja, bacilares / espiral / helicoidais) e não viáveis (ou seja, cocóides).
- Use valores de densidade óptica como meio de estimar o número de bactérias H. pylori viáveis nos inóculos, mas, neste caso, primeiro é necessário gerar uma curva de crescimento. Para isso, os valores de A600 das culturas de H. pylori são monitorados ao longo do tempo e correlacionados diretamente com o número de bactérias viáveis, determinado pela contagem de placas.
nota: Um método conveniente para realizar essas determinações da curva de crescimento é cultivar bactérias em meio líquido (Seção 1.2), usando frascos de cultura de tecidos de fundo plano padrão colocados em uma incubadora de CO10% 2. O número de UFC, determinado a partir de alíquotas das culturas obtidas a cada 4-6 h durante 2-3 dias, é então comparado com os valores correspondentes de A600. É importante ressaltar que curvas de crescimento devem ser geradas para cada cepa de H. pylori, pois elas podem crescer em taxas diferentes e, além disso, nem todas as cepas crescem bem em 10% de CO2.
2. Gavagem intragástrica de camundongos com Helicobacter
NOTA: Este método de gavagem intragástrica pode ser aplicado a outras espécies bacterianas que colonizam o intestino, por exemplo, S. Typhimurium, C. rodentium, Listeria monocytogenes.
- Use camundongos machos ou fêmeas de 6 a 8 semanas de idade, livres de patógenos específicos (FPS) e livres de Helicobacter. Use animais com fundo genético C57BL/6 para experimentos de infecção com H. pylori ou H. felis. No presente estudo, usamos camundongos C57BL/6 do tipo selvagem (WT) e geneticamente modificados sem um receptor imune inato chave (denominado animais knock-out ou KO).
nota: Camundongos de outros antecedentes genéticos também podem ser usados para infecções por Helicobacter, no entanto, os níveis de colonização e a gravidade da doença podem ser afetados pelo tipo de fundo do hospedeiro.
- Aspire o inóculo bacteriano (Etapa 1.5) em seringas descartáveis de 1 mL e substitua as agulhas fornecidas por agulhas de calibre 23 nas quais são afixados cateteres de polietileno descartáveis (comprimento, 6–8 cm; diâmetro interno, 0,58 mm). Prenda os cateteres às agulhas aplicando pequenas tiras de filme plástico (consulte a Tabela de Materiais). Como alternativa, substitua o conjunto agulha/cateter usando tubos de alimentação de plástico estéril (calibre 20 x 38 mm).
- Contenha fisicamente os ratos com um aperto firme na nuca e na cauda.
nota: Este procedimento pode ser realizado sem anestesia ou, alternativamente, com o uso de um anestésico inalatório, como metoxiflurano ou isoflurano.
- Insira o cateter no centro da mandíbula aberta e guie-o na direção caudal em direção ao esôfago. Estenda o pescoço do camundongo para facilitar o acesso ao estômago através do esôfago (e longe da traqueia) até que a maior parte ou todo o cateter não seja mais visível e a resistência seja sentida, correspondendo à base do estômago. Entregar uma alíquota específica, geralmente 100 μL por inoculação (Figura 1).
nota: Os camundongos devem ser gavagados com ≥ 105 UFC para garantir a colonização ideal e a patologia da doença.
