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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Síntese SPIO-MtbsAb
- Sintetizar 2,2'-(etilenodioxi)bisetilamina (EDBE) conjugada com SPIO usando métodos relatados anteriormente.
- Sintetizar anidrido succinico SPIO-EDBE (SA).
- Agitar uma solução alcalina (5 M NaOH; 10 ml)) de SPIO-EDBE e SA (1 g; 10 μmol) à temperatura ambiente durante 24 h.
- Dialisar a solução com 20 trocas de 2 L de água destilada usando tubo de membrana porosa molecular (corte de 12.000-14.000 MW). 6 h para cada troca.
- Finalmente, adicione 100 μL de SPIO-EDBE-SA (4 mg / mL de Fe) a 400 μL de anticorpo de superfície Mycobacterium tuberculosis 4,5 mg / mL (MtbsAb) para sintetizar SPIO-MtbsAb usando 1-hidroxibenzotriazol e (benzotriazol-1-iloxi) hexafluorofosfato de tripirrolidinofosfônio como catalisadores e agite a solução em temperatura ambiente por 24 h.
- Finalmente, separe as soluções do anticorpo não ligado por meio de cromatografia de filtração em gel.
- Carregue a mistura de reação (5 mL) em uma coluna de 2,5 cm × 33 cm e elua usando um tampão salino tampão tampão fosfato (PBS). Confirme o complexo de nanopartículas de Ab (ou seja, nanossonda) usando um kit de ensaio de proteína de ácido bicinconínico.
2. Observação da morfologia das partículas e medição do nível de relaxamento
- Examine o tamanho médio das partículas, a morfologia e a distribuição de tamanho usando um microscópio eletrônico de transmissão a uma tensão de 100 kV.
- Goteje a dispersão do composto em uma grade de cobre de 200 mesh e seque ao ar em temperatura ambiente antes de carregá-la no microscópio.
- Meça os valores do tempo de relaxamento (T1 e T2) das nanossondas usando o relaxômetro de RMN a 20 MHz e 37,0 °C ± 0,1 °C.
- Calibre o relaxômetro antes de cada medição.
- Registre os valores r1 e r2 dos oito pontos de dados gerados por meio da recuperação de inversão e da sequência de pulso Carr-Purcell-Meiboom-Gill, respectivamente, para determinar asrelaxividades r 1 e r2.
3. Imagem celular
- Cultive monócitos humanos THP-1 em RPMI 1640 com 10% de soro bovino fetal, 50 μg/mL de sulfato de gentamicina, 100 unidades/mL de penicilina G sódica, 100 μg de sulfato de estreptomicina e 0,25 μg/mL de fungizona em uma incubadora de 5% de CO2 a 37 °C.
- Incubar nanossondas SPIO-MtbsAb (2 mM) com 106 unidades formadoras de colônias (UFC) de Mycobacterium bovis BCG pré-incubadas com 1 × 107 monócitos ativados em tubos de microcentrífuga (1 mL) em uma incubadora de 5% de CO2 a 37 ° C por 1 h.
- Centrifugar os tubos a 200 x g e rejeitar o sobrenadante. Dissolver novamente os grânulos no meio (200 μL).
- Varrer as amostras usando uma sequência de pulso de eco de gradiente rápido (tempo de repetição (TR) = 500; Tempo de eco (TE) = 20; Ângulo de inversão = 10°) através de ressonância magnética de 3,0 T para determinar a especificidade e sensibilidade da nanossonda.
4. Inoculação de BCG (Bacillus Calmette-Guérin)
- Reconstitua a vacina liofilizada ou o estoque bacteriano no meio de Sauton e, em seguida, dilua o estoque com solução salina até que se disperse adequadamente, conforme descrito anteriormente.
- Inocular uma estirpe viva atenuada de M. bovis BCG, obtida de ADIMMUNE (Taipei, Taiwan) (estirpe de Connaught; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux) em um volume de 0,1 mL / camundongo (ou seja, 107 UFC) por via intradérmica na pele escapular dorsal esquerda ou direita de camundongos, conforme descrito anteriormente. Injete solução salina em camundongos como controle negativo. Monitore os animais diariamente após a inoculação com BCG.
- Sacrificar animais 1 mês após a inoculação de bactérias usando eutanásia de dióxido de carbono. Colha o tecido do local de inoculação intradérmica. Fixe o tecido em formalina a 10% e embeba-o em parafina para cortes seriados a 5-10 μm. Listar seções de tecido com as colorações de hematoxilina/eosina e Ziehl-Neelsen para bactérias álcool-ácido resistentes e com azul de Berlim para ferro férrico.
5. Ressonância magnética in vivo
- Injete cetamina (80 mg / kg de peso corporal) e xilazina (12 mg / kg de peso corporal) por via subcutânea em camundongos para anestesia animal.
- Injete sondas SPIO-TbsAb (2 nmol/200 μL) nas veias da cauda de camundongos. Camundongos com imagem de RM antes e imediatamente após a injeção da sonda e, em seguida, a cada 5 minutos por 30 minutos para adquirir imagens spin-eco rápidas ponderadas em T2 (TR = 3000; TE = 90; campo de visão = 8).
- Analise quantitativamente todas as imagens de RM usando intensidade de sinal (SI), uma medição de regiões de interesse definidas em locais comparáveis de um centro de granuloma de Mtb e o músculo das costas adjacente a uma área granulomatosa.
- Calcule os aprimoramentos relativos do sinal usando a medição SI antes (SIpre; controle) e 0-3 h após (SIpost) injeção dos agentes de contraste usando a fórmula
[(SIpost - SIpre)/SIpre] × 100
onde SIpre é o SI da lesão na varredura pré-aprimorada e SIpós é o SI da lesão na varredura pós-aprimorada.