Um ensaio para detectar explosão oxidativa em discos de folhas de Arabidopsis após elicitação imune

Resumo

Fonte: Bredow, M., et al. Ensaios de Inibição de Crescimento de Crescimento de Plântulas e Explosão Oxidativa Desencadeada por Padrão em Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra um ensaio para medir a explosão oxidativa em folhas de Arabidopsis após a elicitação imunológica. Os discos foliares, cortados das folhas das plantas, são incubados com peptídeos bacterianos que funcionam como padrões moleculares associados a micróbios ou MAMPs. Após a detecção dos MAMPs, as células vegetais induzem a produção de ROS extracelular, que é detectada usando um ensaio de quimioluminescência.

Protocolo

1. Detecção de explosão de ROS em discos foliares de Arabidopsis após elicitação imune

1. Crescimento e manutenção de plantas.
   1. Para sincronizar a germinação, estratificar as sementes de Arabidopsis suspendendo aproximadamente 50 sementes em 1 mL de ágar estéril a 0,1% [p/v] e armazená-las a 4 °C (sem luz) por 3-4 dias.
      nota: Estratificar um controle de fundo do tipo selvagem (por exemplo, Col-0) e genótipos com altos e baixos débitos imunológicos (por exemplo, cpk28-1 e bak1-5, respectivamente) para servir como controles internos.
   2. Semeie no solo e germine em condições padrão de dias curtos (22 °C, 10 h de luz, 150 μE/m²/s de intensidade de luz e 65-70% de umidade relativa).
   3. Após aproximadamente 7 dias, use uma pinça para transplantar mudas individuais para novos vasos, separados por pelo menos 4 cm para permitir o desenvolvimento completo da roseta. Transplante de 6 a 12 mudas por genótipo e retorne às condições padrão de dias curtos. Regue e fertilize regularmente as plantas (1 g/L de fertilizante 20-20-20 a cada 2 semanas).
2. Colete discos de folhas em placas de 96 poços para recuperação durante a noite.
   1. Às 4-5 semanas após a germinação (Figura 1A), use um punção de biópsia afiado de 4 mm para remover um disco foliar por planta, evitando a nervura média e tomando cuidado para limitar o ferimento (Figura 1B). Coloque os discos de folhas em uma placa luminométrica de 96 poços não utilizada contendo 100 μL de água bidestilada (ddH₂O) com o lado adaxial voltado para cima para evitar a dessecação (Figura 1C). Se estiver avaliando vários elicitores, remova 1 disco de folha da mesma folha para cada tratamento com elicitor.
      nota: Folhas de amostra totalmente expandidas, da terceira à quinta a partir do topo da roseta, e aproximadamente do mesmo tamanho e idade para limitar a variabilidade. Se possível, corte os discos das folhas ao meio usando uma lâmina de barbear antes da recuperação durante a noite, pois isso aumenta a área de superfície exposta à solução do elicitor.
   2. Recupere durante a noite à temperatura ambiente para evitar a interferência de ROS produzida por ferimentos durante a coleta do disco foliar. Cubra as placas com uma tampa para evitar a evaporação.
3. Realize o tratamento do elicitor e meça a produção de ROS.
   1. Programe o leitor de placas antes de adicionar a solução de reação, pois isso reduzirá o tempo entre o início da explosão de ROS e as primeiras medições registradas. Use um software comercial apropriado para o leitor de placas. No nosso caso (consulte o Índice), clique em Configurações e selecione o cartucho LUM96 e o tipo de leitura cinética. Clique na categoria Área de Leitura e arraste para selecionar um subconjunto de poços ou a placa inteira a ser lida. Na guia PMT e Óptica, defina o tempo de integração como 1.000 ms. Na guia Temporização, defina o Tempo total de execução como 40-60 min e o Intervalo como 2 min.
   2. Remova a água de cada poço usando uma pipeta multicanal.
      nota: Não perfure os discos das folhas, pois isso pode causar estresse na ferida e resultar em saídas de ROS mais variáveis.
   3. Prepare uma solução de reação contendo 100 μM de luminol, 10 μg/mL de peroxidase de rábano (HRP) e a concentração desejada de elicitor (por exemplo: elf18 a 1 nM, 10 nM, 100 nM ou 1.000 nM) em ddH₂O estéril usando 10 mL de solução para uma placa de 96 poços.
      nota: Dissolva os peptídeos liofilizados em H₂O estéril em tubos de baixa ligação para fazer um estoque de 10 mM, congele rapidamente em N₂ líquido e armazene a -80 ° C. Quando estiver pronto para uso, dilua os estoques em H₂O estéril para gerar um estoque de giro de 100 μM e armazene a -20 °C.
   4. Use uma pipeta multicanal para dispensar 100 μL da mistura de reação em cada poço, adicionando a solução a todos os discos foliares do mesmo tratamento ao mesmo tempo. Incluir uma reação de controle (sem elicitação) para cada genótipo para avaliar os níveis basais de ERO na ausência de elicitação. Meça imediatamente a emissão de luz para todos os comprimentos de onda no espectro visível usando um leitor de microplacas.
      nota: Prepare e aplique a solução de reação sob pouca luz, pois o luminol e o HRP são reagentes sensíveis à luz. Mantenha os reagentes no gelo ou a -20 ° C, a menos que estejam em uso.
   5. Meça a emissão de luz com um tempo de integração de 1.000 ms em intervalos de 2 minutos durante um período de 40-60 minutos em um leitor de microplacas para capturar a explosão oxidativa dinâmica (Figura 1D).
      nota: Use um tempo de integração mais longo para melhorar a sensibilidade do ensaio, garantindo que todas as amostras em uma placa de 96 poços possam ser medidas dentro de um intervalo.

Resultados

Figura 1. Ensaio de explosão oxidativa à base de luminol após indução imune em Arabidopsis. (A) Cultive plantas no solo em condições de dias curtos por 4-5 semanas. (B) Use um punção de biópsia de 4 mm para coletar discos de folhas de cada planta e recuperar durante a noite em ddH2O. (C) Adicione a solução de reação (100 μM de luminol, 10 μg / mL HRP e a concentração desejada de elicitor) e ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
20-20-20 Fertilizante	Produto da planta	Rolamento 10529	Misture 1g/L em água e aplique nas plantas a cada 2 semanas para um crescimento ideal.
Punção de biópsia de 4 mm	Mercado Médico	232-33-34-P	Um conjunto de brocas de cortiça com uma área de superfície de 0,125 cm^2 também pode ser usado.
Pipeta Multicanal Mecânica BioHit mLine 12 (30-300 uL)	Sartorius	Rolamento 725240	Qualquer pipeta multicanal pode ser usada, assim como uma única pipetadora, se necessário.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)	EZ Biolab	Rolamento CP7211	Armazene o peptídeo estoque de 10 mM a -80C em tubos de baixa ligação a proteínas. Quando descongelado, armazene 100 uM de estoque de giro a -20C.
fórceps	Fisher Científico	22-327379
Peroxidase de rábano	Sigma-Aldrich	Pág. 6782	Dissolva em água pura. Armazene a -20C e longe da luz.
Luminol	Sigma-Aldrich	Rolamento A8511	Dissolva em DMSO. Armazene a -20C e longe da luz.
Sais basais de Murisage e Skoog	Laboratórios Cedarlane	MSP09-100LT	Armazene a 4C.
solo	Horticultura SunGrow	Mix de luz do sol # 1	Outros tipos de solo também podem ser usados para cultivar Arabidopsis. Misture com água ao encher panelas.
Leitor de microplacas multimodo SpectraMax Paradigm com módulo LUM	Dispositivos Moleculares		Qualquer leitor de placas capaz de detectar luminescência pode ser usado para esses ensaios.
Placas de poliestireno branco de 96 poços	Fisher Científico	07-200-589