Nós apresentamos dois independentes, microscópio de ferramentas baseadas em medir as deformações induzidas nucleares e citoesqueleto em single, vivendo células aderentes em resposta à aplicação de tensão global ou localizada. Estas técnicas são utilizadas para determinar a rigidez nuclear (ou seja, deformabilidade) e para transmissão de força sonda intracelular entre o núcleo e citoesqueleto.
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Artigo de método
Ensaios biofísicos para investigar as propriedades mecânicas do núcleo da célula Interphase: Aplicação de substrato Strain e Manipulação de microagulhas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Na maioria das células eucarióticas, o núcleo é a maior organela e é geralmente de 2 a 10 vezes mais duro do que o citoesqueleto redor e, conseqüentemente, as propriedades físicas do núcleo contribuir significativamente para o comportamento global biomecânica de células em condições fisiológicas e patológicas. Por exemplo, na migração de neutrófilos e invadindo as células cancerosas, rigidez nuclear pode representar um grande obstáculo durante o extravasamento ou passagem através de espaços estreitos dentro dos tecidos. 1 Por outro lado, o núcleo de células no tecido mecanicamente ativos, tais como o músculo requer suporte estrutural suficiente para suportar o estresse mecânico repetitivo. Importante, o núcleo é totalmente integrado à arquitetura celular, que está fisicamente ligado ao citoesqueleto circundante, que é um requisito essencial para o movimento intracelular e posicionamento do núcleo, por exemplo, em células polarizadas, núcleos sináptica nas junções neuromusculares, ou em células de migração. 2 Não é de surpreender que mutações em proteínas do envelope nuclear, como lamins e nesprins, que desempenham um papel crítico na determinação da rigidez nuclear e nucleo-citoesqueleto acoplamento, tem sido mostrado recentemente para resultar em uma série de doenças humanas, incluindo Emery- Dreifuss distrofia muscular, cinturas pélvica e escapular distrofia muscular e miocardiopatia dilatada. 3 Para investigar a função de diversas proteínas biofísicos envelope nuclear eo efeito de mutações específicas, desenvolvemos métodos experimentais para estudar as propriedades físicas do núcleo em um único, células vivas submetido a global ou localizada perturbação mecânica. Medição induzidos deformações nucleares em resposta ao pedido precisamente aplicado substrato tensão gera informações importantes sobre a deformabilidade do núcleo e permite a comparação quantitativa entre mutações diferentes ou linhas de células específicas para deficientes proteínas do envelope nuclear. Aplicação esforço localizado citoesqueleto com microagulhas é utilizado para complementar este ensaio e pode fornecer informações adicionais sobre a transmissão de força entre o núcleo intracelular e citoesqueleto. Estudar a mecânica nuclear em células vivas intactas preserva a arquitetura normal intracelular e evita artefatos potenciais que podem surgir quando se trabalha com núcleos isolados. Além disso, a aplicação tensão substrato apresenta um bom modelo para o estresse fisiológico experimentado por células em músculos ou outros tecidos (por exemplo, células musculares lisas vasculares expostos a tensão navio). Por último, enquanto que essas ferramentas têm sido desenvolvidas principalmente para estudar mecânica nuclear, eles também podem ser aplicados para investigar a função das proteínas do citoesqueleto e sinalização Mecanotransdução.
Protocolo
1. Aplicação tensão substrato
A medição da tensão nuclear normalizado inclui a preparação de pratos com tensão transparente, membranas de silicone elástico como a superfície de cultura de células, cultivo de células para os pratos, e aquisição de imagens das células antes, durante e depois (uniaxial ou biaxial) a aplicação de tensão.
Preparação de pratos silicone membrana e adesão de células
- Cada prato consiste em um esforço feito por prato fundo de plástico com um diâmetro de 3 "e um plástico-ring para manter uma membrana de silicone, que serve como substrato de cultura de células. Para a preparação d....
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Discussão
Ensaio de tensão substrato
Aplicação cepa tem sido usada com sucesso por nós e outros grupos para estudar as deformações induzidas nuclear em células submetidas a estresse mecânico e investigar a contribuição das proteínas específicas envelope nuclear à rigidez nuclear. 08/04 A vantagem desta técnica é que ela sondas propriedades mecânicas núcleos de viver em seu ambiente normal celular e do citoesqueleto e que a aplicação tensão substrato assemelha-se a aplicação da carga fisiológic.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (R01 e R01 HL082792 NS059348) e do Hospital Brigham and Women Award do Grupo de Liderança Cardiovascular.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | |
| Fibronectina | Millipore | FC010 | |
| MitoTracker Red FM e FM Verde | Invitrogen | M22425 e M-7514 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Saline Hank Sal Buffered | Invitrogen | 14185 | |
| Livre de fenol, DMEM | Invitrogen | 21063 | |
| Soro fetal bovino | Aleken Biologicals | FBSS500 | |
| Penicilina / estreptomicina | Sigma | P0781-100ML | |
| Vidro borosilicato com filamento | Instrumento Sutter | BF100-78-10 | |
| Gloss / folhas silicone Gloss não-reforçada, 0.005 " | Especialidade Manufacturing Inc. | ||
| Phosphate Buffered Saline Dulbecco | Invitrogen | 14200 | |
| 35 milímetros de vidro de fundo placas de cultura (FluoroDish) | Mundial Precision Instruments, INC | FD35-100 | |
| Braycote graxa de vácuo 804 | Suprimentos Spi | 05133A-AB |
Referências
- Friedl, P., Wolf, K., Lammerding, J. Nuclear mechanics during cell migration. Curr Opin Cell Biol. 23, 55-64 (2011).
- Mejat, A., Misteli, T. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1, 40-52 (2010).
- Worman, H. J., Fong, L. G., Muchir, A., Young, S. G.
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Reimpressões e permissões
