Produção de anticorpos a partir de uma cultura de crescimento excessivo em lote de células de mamíferos transfectadas

Resumo

Fonte: Elgundi, Z. et al., Produção em escala laboratorial e purificação de um anticorpo terapêutico.J. Vis. Exp.(2017)

O vídeo demonstra um método para produzir anticorpos terapêuticos usando células de mamíferos transfectadas de forma estável. A suplementação de triptona estimula a divisão celular, resultando em crescimento excessivo e apoiando um maior rendimento de anticorpos. O meio contendo anticorpos é colhido, filtrado e armazenado para uso posterior.

Protocolo

NOTA: Deve ser utilizado um vector de expressão de mamíferos adequado para este protocolo. Aqui, uma única construção contendo dois de expressão é usada (ou seja, a expressão de cadeia pesada e leve é conduzida por promotores separados). As cadeias pesadas e leves de trastuzumabe foram previamente clonadas no vetor. Este vetor foi um presente de Andrew Beavil, obtido por meio de um repositório de plasmídeos sem fins lucrativos.

1. Recuperação e aumento de escala do DNA vetorial

NOTA: O DNA do vetor foi recebido como uma cultura de facada em ágar mole na cepa Escherichia coli XL-1 Blue; o vetor carrega resistência à higromicina.

1. Inserir uma facada ou alça de inoculação estéril no ágar mole da cultura de faca e, em seguida, estriar uma placa de ágar Luria Bertani (LB) preparada com 75 μg/ml de higromicina para colónias isoladas. Incubar a placa a 37 °C durante 18-24 horas.
2. Inocular uma única colónia em 5 ml de caldo Terrific (TB) contendo 75 μg/ml de higromicina. Incubar a cultura a 37 °C durante 18-24 horas agitando a 225 rpm.
3. Use a cultura durante a noite para preparar um estoque de glicerol de DNA vetorial misturando suavemente 800 μl de cultura com 200 μl de glicerol a 80% em um criovírus e congele a -80 ° C.
   1. Adicionar 100 μl da cultura durante a noite a 100 ml de TB contendo 75 μg/ml de higromicina num agitador defletor (ou seja, diluição de 1/1.000). Incubar a cultura a 37 °C durante 18-24 horas com agitação de 225 rpm.
4. Após a cultura durante a noite, extrair e purificar o ácido nucleico (ADN) desoxirribose de acordo com as instruções do fabricante para o kit de preparação midi/maxi, com a seguinte excepção: durante o passo final, eluir ou ressuspender o ADN com água (pH 7,0-8,5).
5. Verificar a concentração e a pureza do ADN através de leituras de absorvância a 260 e 280 nm e, em seguida, armazenar o ADN a -20 °C.
   NOTA: Opcional (altamente recomendado): Sequenciar DNA usando primers específicos do vetor para confirmar a identidade.

2. Transfecção estável de células HEK-293

1. Cultive e mantenha células HEK-293 (células em suspensão) de acordo com protocolos padrão em meios sem soro suplementados com surfactante não iônico a 0,1% em frascos Erlenmeyer. Manter a 2 x 10⁵ células/ml e subcultivar de quatro em quatro dias. Células de cultura a 37 °C com 5% de dióxido de carbono (CO₂) e rotação de 120 rpm.
   NOTA: As células devem estar em cultura por não menos de 4 dias e não mais de 4 semanas antes da transfecção. Células HEK-293 cultivadas como monocamadas em meios contendo soro também podem ser usadas para este procedimento.
2. No dia anterior à transfecção, semear células HEK-293 a 3 x 10⁵ células/ml em poços de uma placa de 12 poços em 2 ml de Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS). No dia da transfecção, verifique se as células atingiram 80-90% de confluência
3. Dilua o DNA e a polietilenimina (PEI) separadamente no meio de transfecção e misture-os.
   1. Diluir 1,25 μg de DNA vetorial por poço (15 μg para 12 poços) em 300 μl de meio de transfecção. Incubar em temperatura ambiente por 5 min.
   2. Diluir 2,5 μl de solução de PEI a 1 mg/ml (30 μl para 12 alvéolos, ou seja, proporção de 1:2 de ADN/PEI) em 300 μl de meios de transfecção. Incubar em temperatura ambiente por 5 min.
   3. Adicione DNA diluído ao PEI diluído, misture suavemente e incube em temperatura ambiente por 15 min.
4. Adicionar 50 μl de mistura de ADN/PEI gota a gota a cada alvéolo da placa. Agite a placa suavemente para distribuir a mistura de transfecção e, em seguida, coloque a placa a 37 ° C, 5% de CO₂ por 24 horas.
5. Adicionar 50 μg/ml de higromicina B por alvéolo e retornar a placa a 37 °C, 5% de CO₂ por 10 dias.
   NOTA: No dia 10, as células não transfectadas terão morrido e se separado da superfície da placa, enquanto as células transfectadas de forma estável estarão viáveis e presas à placa.
6. Substitua o meio em poços por meio sem soro de 1/4 de volume e DMEM de 3/4 de volume suplementado com 10% de FBS (ou seja, 0,5 ml de meio sem soro + 1,5 ml de DMEM = 7,5% de concentração sérica final) e incube por 4 dias.
7. Substitua o meio nos alvéolos por meio sem soro de 1/2 volume e DMEM de 1/2 volume suplementado com 10% de FBS (ou seja, 1 ml de meio sem soro + 1 ml de DMEM = 5% de concentração sérica final) e incube por 4 dias.
8. Substitua o meio em alvéolos por meio sem soro de 3/4 de volume e DMEM de 1/4 de volume suplementado com 10% de FBS (ou seja, 1,5 ml de meio sem soro + 0,5 ml de DMEM = 2,5% de concentração sérica final) e incube por 4 dias.
9. Substitua o meio nos alvéolos por 2 ml de meio sem soro suplementado com surfactante não iônico a 0,1% (ou seja, concentração sérica final de 0%) e incube por 4 dias.
   NOTA: Mantenha uma pressão seletiva de 50 μg / ml de higromicina B nas células durante a adaptação sem soro. As células adaptadas ao meio livre de soro se desprendem da superfície dos poços e podem se agrupar em suspensão. Consulte a etapa 2.1 para condições de cultura com o suplemento adicional de 50 μg / ml de higromicina B.
10. Usando uma pipeta, misture suavemente as culturas de suspensão na placa de 12 poços e as células do pool em um tubo separado.
    1. Enumerar as células agrupadas e semear num balão Erlenmeyer, utilizando um hemocitómetro, num erlenmeyer, a 2 x 10,5 células/ml. Cultivar células a 37 °C com 5% de CO₂ e rotação de 120 rpm. Subcultura e expansão a cada quatro dias.
11. Continue a expandir o tamanho da cultura para a densidade celular necessária para obter 10 frascos a 1 x 10⁷ células/frasco para criopreservação em nitrogênio líquido. Congelar as células em meio sem soro contendo 10% de dimetilsulfóxido (DMSO).
    NOTA: Meios condicionados contendo anticorpos podem ser colhidos em cada subcultura para confirmar a produção de proteínas ou usados para otimizar as condições de purificação. Para colher meios condicionados e manter as células para subcultura, centrifugue a cultura a 300 x g por 5 min e, em seguida, filtre-esterilize o sobrenadante através de um filtro de 0,22 μm. O sobrenadante filtrado pode ser mantido a 4 °C durante 1-2 semanas ou a -20 °C para armazenamento a longo prazo.

3. Produção de anticorpos em larga escala a partir de cultura de crescimento excessivo em lote

NOTA: A produção de anticorpos pode ser acompanhada a partir da etapa 2.11, onde as células existentes são expandidas para a densidade celular necessária com base no volume de cultura de crescimento excessivo do lote a ser configurado. Caso contrário, as células que foram descongeladas da criopreservação começam neste estágio, uma vez expandidas para uma densidade e volume celular apropriados. Vários suplementos de cultura podem ser usados para otimizar a produção de anticorpos; O uso de triptona para aumentar o rendimento de anticorpos é demonstrado neste protocolo.

1. Células de sementes a 2 x 10⁵ células/ml em 100 ml de meio isento de soro em dois frascos Erlenmeyer (para comparar o rendimento de anticorpos de culturas não suplementadas e suplementadas com nutrientes). Cultura a 37 °C, 5% CO₂ e 120 rpm.
2. Após 24 horas, adicione triptona a uma concentração final de 0,5% à cultura suplementada com nutrientes. Equalize o volume de cultura não suplementada com meios sem soro.
3. A partir do dia 8, realizar contagens celulares das culturas diariamente usando um hemocitômetro para monitorar a viabilidade celular. Colha os sobrenadantes da cultura quando a viabilidade celular for inferior a 80%.
   1. Colha o sobrenadante por centrifugação das culturas a 3.000 x g por 15 min e, em seguida, esterilize por filtro o sobrenadante (contendo anticorpo) através de um filtro de 0,22 μm. Conservar os sobrenadantes a 4 °C (a curto prazo) ou congelar a -20 °C (a longo prazo).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Série vetorial pFUSE	N/A	InvivoGen	Genes de anticorpos pesados e leves expressos em vetores separados que requerem co-transfecção.
Série vetorial mAbXpress	N/A	ACYTE Biotech Pty Ltda.	Genes de anticorpos pesados e leves expressos em vetores separados que requerem co-transfecção. Consulte: Jones, M. L. et al. Um método para reformatação rápida e independente de ligação de anticorpos monoclonais recombinantes. J Métodos Imunológicos. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
vetor pVITRO1	N/A	N/A	Os genes de anticorpos pesados e leves são acionados por um promotor separado em um único vetor. Consulte: Dodev, TS et al. Um kit de ferramentas para clonagem rápida e expressão de anticorpos recombinantes. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
Série vetorial GS	N/A	Lonza	Vetor multicistrônico com genes de anticorpos pesados e leves co-expressos e traduzidos como transcrito único.
Série multi-cistrônica do vetor 1	N/A	N/A	Vetor multicistrônico com genes de anticorpos pesados e leves co-expressos e traduzidos como transcrito único. Consulte: Li, J. et al. Um estudo comparativo de diferentes desenhos vetoriais para a expressão de anticorpos IgG recombinantes em mamíferos. J Métodos Imunológicos. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Série 2 do vetor Multi-cistronic	N/A	N/A	Vetor multicistrônico com genes de anticorpos pesados e leves co-expressos e traduzidos como transcrito único. Consulte: Ho, SC et al. Vetores tricistrônicos mediados por IRES para aumentar a geração de linhas celulares CHO que expressam anticorpos monoclonais altos. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-Trastuzumabe-IgG1/κ	Nº 61883	Addgene	Vetor de expressão de mamíferos contendo genes de anticorpos trastuzumabe com gene de resistência à higromicina; pVITRO1-Trastuzumabe-IgG1/κ foi um presente de Andrew Beavil.
Ágar higro de mídia rápida	FAS-HG-S	Pesquisa de Vida Jomar	Utilizado para preparar ágar LB com baixo teor de sal contendo 75 μg/ml de higromicina.
Mídia rápida Hygro TB	fas-hg-l	Pesquisa de Vida Jomar	Usado para preparar caldo TB com baixo teor de sal contendo 75 μg/ml de higromicina.
Glicerol, BioXtra, ≥99%	G6279	Sigma-Aldrich	Prepare a 80% com água e autoclave. Armazene em temperatura ambiente.
Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit	G221020	Astral Científico	Kit de preparação de plasmídeo Maxi; eluir ou ressuspender DNA em água (pH 7,0-8,5).
Células FreeStyle 293-F	R790-07	Tecnologias da Vida	Linhagem celular HEK-293 adaptada à cultura em suspensão em meio sem soro.
FreeStyle 293 Expression Médio	Rolamento 12338-018	Tecnologias da Vida	Meios sem soro especialmente formulados para manutenção da linhagem celular 293-F e alta expressão proteica.
Kolliphor P188	K4894	Sigma-Aldrich	Surfactante não iônico; Plurônico F-68; preparar a 10% em água e esterilizar com filtro de 0,22 μm. Armazene a 4oC.
DMEM, glicose alta	11995-065	Tecnologias da Vida
Soro fetal bovino inativado pelo calor	10082-147	Tecnologias da Vida
Polietilenimina Linear, MW 25.000	Rolamento 23966	Policiências, Inc.	Preparar para 1 mg/ml em água. Ajuste para pH 7,0 com HCl 1 M (a solução torna-se límpida) e esterilize com filtro de 0,22 μm. Armazene a -80oC até o uso.
OptiPro SFM	12309-050	Tecnologias da Vida	Meios sem soro formulados para transfecção
Solução de higromicina B	formiga-hg-1	Pesquisa de Vida Jomar
Dimetilsulfóxido (DMSO)	AJA2225	Thermo Fisher Científico
Triptona (peptona de caseína)	LP0042B	Thermo Fisher Científico	Preparar a 20% em PBS e esterilizar com filtro de 0,22 μm. Armazene a 4oC.
Sistema BLItz	45-5000	fortéBIO	Instrumento usado para medições de interferometria de biocamada (BLI).