Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Coleta de pellets fecais frescos
- Prepare toalhas de papel estéreis, pinças de ponta romba e tubos cônicos de 50 mL.
- Coloque algumas toalhas de papel e pinças em sacos de autoclave separados e autoclave-os a 180 °C em calor seco por 30 min. Use também tubos cônicos estéreis. Pese os tubos cônicos e anote seu peso nos tubos.
- Ligue o armário de biossegurança na sala dos animais.
- Pegue uma gaiola de rato limpa autoclavada sem qualquer roupa de cama e coloque-a no armário de biossegurança. Retire a tampa e a prateleira de alimentos e coloque-as dentro do armário.
- Coloque algumas toalhas de papel estéreis no fundo da gaiola e coloque o rack de metal de volta em cima da gaiola.
- Identifique doadores fecais pareados por idade e coloque a gaiola do rato no gabinete de biossegurança. Abra a gaiola e pegue suavemente um camundongo doador (C57BL/6J) pela cauda e coloque-o no rack de metal em cima da gaiola limpa.
- Coloque a tampa da gaiola em cima do rack e espere o(s) animal(is) defecar.
NOTA: Coloque alguns irmãos de ninhada de camundongos no rack simultaneamente.
- Colete os pellets fecais e coloque-os em um tubo cônico estéril de 50 mL. Agrupe os pellets por sexo. Não misture pellets fecais coletados de machos e fêmeas.
- Pese o tubo novamente e calcule o peso dos pellets fecais.
2. Preparação da suspensão fecal
- Prepare uma solução estéril (glicerol a 10% em solução salina normal).
- Adicionar 10 mL de glicerol a 10%/soro fisiológico ao tubo cônico para cada grama de pellets fecais.
NOTA: Aumente o volume da solução para 20 mL, se necessário. Este estudo também utilizou 1 mL de solução para cada pellet (5-10 mg).
- Homogeneizar a mistura em baixa velocidade com um homogeneizador de bancada ou um liquidificador dentro de uma capela para ressuspender as fezes (3 X 30 s).
- Filtre a suspensão fecal através de 2 camadas de gaze de algodão estéril (10,2 cm x 10,2 cm). Conservar o filtrado temporariamente no frigorífico durante um período máximo de 6 h ou acondicioná-lo em frascos criogénicos estéreis e conservá-lo num congelador a -80 °C.
- Limpe completamente o homogeneizador ou liquidificador seguindo um procedimento padrão.
3. Administração de suspensão fecal por sonda oral
- Descongele a suspensão fecal congelada no gelo se estiver usando amostras congeladas. Misture a suspensão fecal descongelada por vórtice.
- Transfira a suspensão fecal fresca ou descongelada para seringas de 1 mL.
NOTA: Cada camundongo receberá um total de 200 μL de suspensão fecal, e cada camundongo IL-10-/- no grupo controle receberá 200 μL de glicerol a 10% / solução salina normal.
- Pese os camundongos e escolha o tamanho certo da agulha de gavagem e o volume máximo de dosagem.
NOTA: Para camundongos com peso corporal entre 20-25 gramas, use uma agulha de gavagem curva de 20 G e 3.81 cm com uma bola de 2.25 mm. Por favor, verifique gavageneedle.com para obter mais informações.
- Teste a agulha de gavagem medindo o comprimento da ponta do nariz do camundongo até o processo xifóide (parte inferior do esterno). Encha a seringa com glicerol a 10% / solução salina ou suspensão fecal e remova as bolhas de ar dentro da seringa e da agulha.
NOTA: Se a agulha for maior que o comprimento, marque o eixo/tubo da agulha no nível do nariz. Não passe a agulha/tubo pelo animal além desse ponto para evitar a perfuração gástrica.
- Coloque uma gaiola de rato no gabinete de biossegurança, remova a tampa plástica da gaiola e deixe o rack de metal no lugar.
- Pegue um mouse pela cauda e coloque-o na prateleira de metal. Segure o rato pela cauda com uma mão e use o polegar e os dedos médios da outra mão para conter o animal, segurando a pele sobre os ombros. Dessa forma, as patas dianteiras são esticadas para o lado, o que evitará que as patas dianteiras empurrem a agulha para fora. Estenda suavemente a cabeça do animal para trás e segure a cabeça no lugar com uma mão.
NOTA: Pratique o manuseio do mouse até que o experimentador tenha total confiança antes de prosseguir com o experimento.
- Coloque a agulha de gavagem em cima da língua dentro da boca. Avance suavemente ao longo do palato superior até que a agulha atinja o esôfago. Passe a agulha suavemente em um movimento. Não force a agulha se sentir alguma resistência. Retire a agulha e tente novamente.
- Uma vez que a agulha esteja devidamente colocada e verificada, administre lentamente o material empurrando a seringa presa à agulha. Não gire a agulha nem empurre a agulha para frente, o que pode romper o esôfago. Após a dosagem, puxe suavemente a agulha para fora.
- Retorne o mouse para sua gaiola inicial. Monitore o animal por 5 a 10 minutos, procurando sinais de respiração difícil ou angústia. Monitore os camundongos novamente entre 12-24 h após o FMT.
