Uma técnica de co-cultura para diferenciar células progenitoras neurais humanas em neurônios

Resumo

Fonte: Su, C. T. E., et al. Uma abordagem optogenética para avaliar a formação de conexões neuronais em um sistema de co-cultura. J. Vis. Exp. (2015).

Este vídeo demonstra um método para diferenciar células progenitoras neurais humanas (NPCs) em neurônios. Os NPCs são introduzidos em uma co-cultura estabelecida de neurônios corticais de astrócitos de camundongos e ratos, promovendo a diferenciação de NPCs em neurônios. A diferenciação é confirmada pela visualização das células sob um microscópio confocal.

Protocolo

1. Geração de células-tronco pluripotentes induzidas

1. Cultura de fibroblastos humanos em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) em placas de 6 poços.
2. Antes de iniciar a reprogramação dos fibroblastos, cubra 6 poços com Matrigel e incube por pelo menos uma hora em temperatura ambiente. A 80% de confluência, remova o meio das culturas de fibroblastos e lave uma vez com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS).
3. Adicione tripsina-EDTA a 0,25% suficiente para cobrir toda a placa e incube a 37 °C por 10 min.
4. Uma vez que as células tenham se desalojado dos poços, adicione o dobro da quantidade de DMEM com 10% de FBS do que a de tripsina para extinguir a digestão da tripsina. Pipete suavemente a suspensão de células para cima e para baixo para quebrar as células. Conte o número de células únicas com um hemocitômetro.
5. Transferir 7 x 10⁵ células para um tubo de centrifugação de 15 ml e centrifugar a suspensão celular a 200 x g durante 5 min.
6. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em solução de eletroporação. Eletropore os fibroblastos de acordo com as instruções do fabricante. Ressuspenda as células em 100 μl de tampão de eletroporação e adicione 1 μg de cada vetor epissómico. Células eletroporadas com configurações de 1.650 V, 10 ms e 3 pulsos de tempo.
7. Transfira a suspensão celular para o Meio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado com 10% de FBS e placa 5 x 10⁴ células por poço de uma placa de 6 poços. Incubar as placas a 37 °C e 5% de CO₂.
8. Após 48 horas, remova o meio das culturas de fibroblastos transfectados e substitua por meio mTeSR. Substitua os meios de cultura diariamente até que as colônias de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) estejam prontas para serem isoladas. As colônias de iPSC podem ser observadas após 28-35 dias.
9. Quando estiver pronto para o isolamento, corte mecanicamente uma colônia de iPSC e semeie novamente em meio mTeSR com 10 μM de inibidor de proteína quinase associada a Rho (ROCK) (Y-27632) em uma placa de 6 poços revestida com Matrigel. Substitua o meio de cultura diariamente.

2. Indução Neural e Manutenção de NPCs Humanos

1. Quando as culturas de iPSC estiverem em torno de 20% de confluência, remova o meio mTeSR e substitua por meio de indução neural. Reabasteça o meio a cada dois dias.
2. Após 7 dias, remova o meio de indução neural e substitua por meio de manutenção NPC humano. Reabasteça o meio a cada dois dias até 7 dias antes de passar as culturas.
3. Antes de passar as culturas, cubra as placas/frascos com Matrigel à temperatura ambiente por pelo menos uma hora.
4. Remova a mídia de culturas NPC humanas confluentes e lave uma vez com 1x PBS e aspire o PBS.
5. Adicione solução de descolamento celular suficiente para cobrir todos os poços e incube por 5 min a 37 °C.
6. Certifique-se de que todas as células tenham sido desconectadas. Adicione o dobro da quantidade de DMEM / F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12) como a da solução de descolamento celular para os poços / frascos.
7. Transferir as células contendo DMEM/F-12 para um tubo de centrifugação de 15 ml e centrifugar a 200 x g durante 5 min.
8. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 5 ml de meio de manutenção de NPC humano. Pipete suavemente a suspensão de células para cima e para baixo para quebrar as células.
9. Coloque um terço do total de células em poços/frascos de cultura revestidos com Matrigel e complete meio suficiente suplementado com 10 μM de Y-27632. Incubar os recipientes de cultura a 37 °C e 5% de CO₂.
   1. Divida as culturas 1:3 a cada 3 a 4 dias e reabasteça o meio a cada dois dias. Mantenha as culturas de NPCs humanos em alta densidade para evitar a diferenciação.

3. Diferenciação de NPCs Humanos em Neurônios em Co-culturas

1. Adicione o vetor lentiviral Synapsin1-tdTomato à cultura de NPC humano antes de iniciar a diferenciação em neurônios. Prepare co-culturas de astrócitos / neurônios corticais com um dia de antecedência antes de diferenciar NPCs humanos.
2. Lave as culturas de NPC humanos uma vez com 1x PBS e adicione solução de descolamento celular suficiente para cobrir todos os poços/frascos e incube por 5 min a 37 °C.
3. Certifique-se de que todas as células tenham sido desconectadas. Adicionar aos alvéolos os alvéolos com o dobro da quantidade de DMEM/F-12 do que a quantidade de solução de descolamento de células. Transferir para um tubo de centrifugação de 15 ml. Centrifugue a 200 x g por 5 min.
4. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 5 ml de meio de diferenciação neuronal. Pipete suavemente a suspensão de células para cima e para baixo para quebrar o pellet celular em células individuais. Conte o número de células únicas com um hemocitômetro.
5. Aspire cuidadosamente o meio de culturas de neurônios astrócitos / corticais. Placa de NPCs humanos a 5 x 10³ células/^cm2 em 500 μl de meio de diferenciação neuronal suplementado com 10 μM de Y-27632 para cada 24 poços. Adicione suavemente NPCs humanos contendo meio em cada poço para evitar perturbar os astrócitos e neurônios corticais.
6. Incubar as placas a 37 °C e 5% de CO₂. Substitua metade do meio por meio fresco a cada dois ou três dias por pelo menos 28 dias.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de reprogramação iPSC epi5 episómica	Invitrogen	A15960
DMEM/F12	Lonza	12719F
Matrigel	BD Biociências	354277
Meio neurobasal	Invitrogen	21103049
Bsa	sigma	Rolamento A7906
Pbs	Thermo Científico	SH30028.02
Tubo de centrífuga de 15 ml	BD Biociências	352096
Tripsina-EDTA	Invitrogen	25200056
Tubo de centrifugação de 50 ml	BD Biociências	Rolamento 352070
Placas de 24 poços	Corning	9761146
Placas de 6 poços	Corning	720083
Balões T25	Corning	430641
Sistema de transfecção de néon	Invitrogen	MPK5000	Para eletroporação de fibroblastos humanos
Fibroblastos humanos dérmicos normais	PromoCell	C12300
pLenti-Sinapina-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE	Addgene	20945