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Nosso protocolo começa com um método para se adaptar iPSCs humanos a culturas alimentador livres, seguida de protocolos para a transfecção de iPSCs humanos usando GeneJuice (EMD) e nucleofection de iPSCs humanos usando um dispositivo AMAXA nuclefector.
Nota: Os seguintes procedimentos são realizados numa chaminé de fluxo laminar estéril. Todos os meios e soluções são equilibradas a 37 ° C ou à temperatura ambiente antes de iniciar a menos que especificado de outra forma.
1. Estabelecer iPSCs humanos no alimentador-livres
IPSCs humanos previamente mantidos em células alimentadoras podem ser divididos e transferidos para Geltrex revestido prato e mantida por duas passagens antes do alimentador sem transfecção.
- Descongelar Geltrex durante a noite a 4 ° C. Para preparar o revestimento Geltrex, diluir descongelado Geltrex 1:50 em DMEM frio. Misturar as soluções suavemente.
Nota: Geltrex, como Matrigel é uma forma solúvel de MATR membrana basalix purificadas a partir de murino Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) células tumorais. Alternativamente, Matrigel pode ser usado como uma matriz extracelular de estabelecer alimentador sem culturas humanas IPSC.
- Cobrir a totalidade da superfície dos poços de cultura com Geltrex solução (1 ml para um poço de 35 mm). Casaco poços com Geltrex a 37 ° C durante 1 hora incubadora.
- Para iPSCs passagem humanos, adicionar 1 ml de Accutase por poço e incubando a 37 ° C durante 1 min, até a maioria das células começam a separar.
Para iPSCs passagem humanos, adicionar 1 ml de Accutase por poço e incubando a 37 ° C durante 1 min, até a maioria das células começam a separar.
- Adicionar 10-15 pérolas de vidro para as células e agitar suavemente a placa. Adicionar 2 ml de DMEM KnockOut / F12 e triturar suavemente. Transferir a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 10 ml.
- Girar as células a 800 rpm durante 3 minutos à temperatura ambiente.
- Aspirar o sobrenadante dos tubos, deixando humano iPSC pellet intacto. Agite suavemente o tubo paradispersar pellet celular.
- Remover Geltrex do poço revestido.
- Gentilmente ressuspender o pellet em iPSC humano num volume apropriado de STEMPRO. Distribuir entre os poços de alimentadores, dependendo da taxa de proliferação celular). IPSCs humanos podem ser passadas em uma razão de divisão de 1:2 a 1:6.
- Cuidadosamente lugar em 5% CO 2 incubadora, redemoinho a placa cuidadosamente para assegurar uma distribuição uniforme de células em poços.
- Células de alimentação diários até que as células estão prontas para ser dividido de novo (quando as células atingem a confluência de 80%).
- IPSCs passagem em humanos bem novo Geltrex revestido (passo 1,3-1,9) em uma razão de divisão de 1:2. Colónias pequenas devem ser formados e distribuídos uniformemente sobre Geltrex revestido bem antes da transfecção.
2. A transfecção de iPSCs humanos com GeneJuice
As células (cultivadas em placas de 6 poços), devem ser, aproximadamente, 40 a 50% confluentes no dia da transfecção para atingir a eficiência de transfecção óptima. Énão é necessário mudar o meio da célula até ao dia seguinte.
- Preparar 100 uL KO-DMEM/F12 em 1,5 ml de um tubo eppendorf estéril. Adicionar 27 ul de reagente de transfecção GeneJuice. Misturar bem. Incubar à temperatura ambiente durante 5 minutos.
- Adicionar 4 ug de ADN do plasmídeo. Incubar o tubo à temperatura ambiente durante 15 minutos. A escolha do plasmídeo é crítico para a eficiência de transfecção óptima. Usamos um plasmídeo com uma proteína de fluorescência verde melhorada (eGFP) conduzido por promotor CAG 5 (pCAG-eGFP). CAG promotor é um promotor forte que é transcripcionalmente activo em iPSCs humanos e, assim, pode ser utilizado para dirigir a expressão do transgene em tais células. Em nossas mãos, linearização de plasmídeo não parecem afetar a eficiência de transfecção.
- Adicionar GeneJuice DNA-mistura para as células e redemoinho da placa. Girar a placa a 1200 rpm durante 5 minutos (método de 'spinoculation'), para aumentar o contacto da mistura de transfecção com iPSCs humanas sobre o poço.
- Incubar as células a 37 ° C durante a noite.
- Monitorar a eficácia de transfecção, no dia seguinte.
- Para transfecção estável, alterar médio no dia seguinte com STEMPRO fresco. Adicionar selecção antibiótica apropriada após 24 - 48 horas.
3. Nucleofection de iPSCs humanos
IPSCs humanos cultivados em alimentadores ou Geltrex pode ser usado para nucleofection. No entanto, recomendamos repique nucleofected iPSCs humanos para os fibroblastos embrionário (MEF) ou fibroblastos prepúcio humano (HFF) alimentadores para garantir a viabilidade das células de alta e recuperação. Pelo menos 2 milhões de células deve ser utilizado para alcançar a sobrevivência celular após mais nucleofection.
- Prepare alimentador de células-meio condicionado (MC), incubando KnockOut iPSC soro humano de reposição (KOSR) meio com células alimentadoras durante a noite. Colete CM a cada 24 horas.
Nota: Qualquer estirpe de ratinho utilizada para a preparação de camadas alimentadoras (como BLK6, CF1 e MF1) é adequado para ser usado for tornando CM.
- No dia da nucleofection, pré-tratamento de humanos com 10 iPSCs inibidor ROCHA uM durante pelo menos 1 hora.
- Preparar 82 ul de solução de Nucleofector humano de células estaminais em 1,5 ml de um tubo eppendorf estéril. Adicionar 18 ul de complemento 1. Misturar bem. Incubar solução a 37 ° C durante 5 mins.
- Pré-aquecimento alimentador célula-condicionado meios de comunicação (CM) e 0,25% de tripsina / EDTA a 37 ° C. Sob o capô, prelabel um tubo estéril 15 ml.
- Remova cuidadosamente a mídia da cultura iPSC humano a ser nucleofected. Lavar suavemente as células com 2 ml de solução de fosfato de 1X tampão (PBS) por poço. Aspirar o PBS. Adicionar 1 ml de tripsina a 0,25% por poço. Incube as células a 37 ° C durante 3 minutos.
- Triturar suavemente as células com 1000 ml ponta da pipeta. Lava-se a parte inferior do poço, para garantir que todas iPSCs humanos são completamente separadas. Transferir a suspensão de células do tubo rotulado 15 ml cónico.
Nota: tripsinização em c únicoells deve ser estritamente evitada. As células devem apenas ser desalojada em pequenos aglomerados de células consistiu em aproximadamente tripletos de células. Pequenos aglomerados de células (células triplos) será dissociado em células individuais durante o manuseamento subsequente das células.
- Adicionar 9 ml de mídia do MEF para inativar a tripsina. Girar as células a 800 rpm durante 3 minutos. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e deixar o sedimento de células intactas.
- Ressuspender as células em 100 uL de solução pré-aquecida de células estaminais humanas Nucleofector do Passo 3.3.
- Transferir as células para uma cuvete de Nucleofector utilizando uma ponta de pipeta de 1 ml.
- Adicionar 4 ug de DNA do plasmídeo para a suspensão de células na cuvete. Misture células e de DNA por movimentos lentos. Toque a cuvete duas vezes sobre a superfície capuz.
- Coloque a célula no suporte Nucleofector. Usar programas B-016. Células Nucleofect pressionando o botão X.
< > Será exibida quando o processo nucleofection é completed (normalmente leva apenas 1-5 segundos). O uso de outros programas nucleofection (A-023, A-033 e U-023) produziram menos de 10% de células positivas para eGFP de iPSCs humanos.
- Recuperar células da cuvete nucleofected usando a pipeta de Pasteur de plástico fornecido. Recuperar células por ressuspensão em CM pré-aquecido e inibidor de rocha em 1,5 ml estéril tubo eppendorf. Incube as células a 37 ° C durante 10 minutos para permitir que as células recuperam.
- Células de transferência de gota a gota, em camadas de alimentação com 1 ml ponteira. Incubar as células a 37 ° C durante a noite.
- Monitorar a eficácia de transfecção, no dia seguinte. Para obter clones estáveis de transgênicos iPSCs humanos que expressam estavelmente transgene, mudar médio no dia seguinte com CM e inibidor ROCK. Adicionar selecção antibiótica apropriada após 24 - 48 horas.
4. Resultados representativos:
Figura 1. Fotomicrografias de Riv1 iPSCs humanas transfectadas com pCAG-eGFP. (A) expressam eGFP Riv1 células transfectadas utilizando GeneJuice Geltrex em 12 horas pós-transf ecção. As colónias de Riv1 iPSCs humanos plaqueadas e formado em alimentadores seguintes nucleofection usando B-016 (B) e A-023 (C) do programa. (D) de forma estável que expressam eGFP-humanos colónias iPSC com expressão ubíqua eGFP derivado GeneJuice. (E) estavelmente transfectadas Riv1 iPSCs humanos retido expressão constitutiva eGFP durante a diferenciação do corpo embryoid.