Imagem de cálcio em neurônios individuais que regulam o comportamento de postura de ovos em Caenorhabditis elegans

Resumo

Fonte: Ravi, B. et al., Imagem raciométrica de cálcio de neurônios individuais em comportamento Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra uma técnica para imagens de cálcio em neurônios individuais de Caenorhabditis elegans em comportamento usando proteínas repórteres fluorescentes geneticamente codificadas. Ele descreve as etapas envolvidas na imagem do movimento do verme e na medição das taxas de fluorescência repórter dos neurônios para correlacionar os níveis de cálcio intracelular com a atividade neuronal e as mudanças comportamentais durante a postura dos ovos.

Protocolo

1. Cepas, meios de cultura e montagem de animais

1. Cultive vermes C. elegans a 20 ° C em placas de ágar padrão de meio de crescimento de nematóides (NGM) de 60 mm semeadas com alimento bacteriano OP50 E. coli.
2. Prepare dois plasmídeos para cada promotor específico da célula de interesse: um, conduzindo a expressão de GCaMP5 para registrar Ca²⁺ intracelular, e o segundo, conduzindo a expressão de mCherry para permitir a quantificação raciométrica das mudanças de fluorescência de GCaMP5 e simplificar a localização e medição de objetos.
   nota: A imagem raciométrica GCaMP5:mCherry corrige as flutuações na fluorescência do GCaMP5 que resultam de mudanças no foco e no movimento do animal, não de mudanças reais no Ca²⁺ intracelular.
3. Injete plasmídeos que expressam GCaMP5 e mCherry junto com o plasmídeo marcador de resgate visível pL15EK nas gônadas de animais mutantes LX1832 lite-1 (ce314), lin-15 (n765ts) X e recupere animais não Muv lin-15 (+) expressando GCaMP5 e mCherry de um transgene de alta cópia. Use o fundo mutante lite-1 para reduzir o comportamento de evitação de luz azul.
4. Integrar transgenes aos cromossomos para reduzir o mosaicismo e simplificar a geração de cepas mutantes compostas.
   nota: A cepa LX2004 descrita aqui carrega um transgene integrado de alta cópia que expressa GCaMP5 e mCherry nos HSNs do promotor nlp-3 (ver Tabela de Materiais). Descobriu-se que o promotor nlp-3 conduz uma forte expressão nas HSNs de L4 tardio e animais adultos sem causar defeitos significativos no desenvolvimento da HSN ou no comportamento de postura de ovos em comparação com outros promotores testados (por exemplo, tph-1, egl-6 e unc-86). Esta cepa e outras que expressam GCaMP5 e mCherry nos neurônios motores do cordão ventral (VC), músculos vulvares e células neuroendócrinas uv1 estão disponíveis no Caenorhabditis Genetics Center, e detalhes de sua construção foram descritos.
5. Aplique o alimento bacteriano OP50 de uma placa de ágar NGM semeada no fundo de um picareta de verme de platina e use-o para transferir ~ 20 animais L4 LX2004 tardios que expressam GCaMP5 e mCherry nos HSNs do promotor nlp-3. Certifique-se de que a vulva em desenvolvimento apareça em um estereomicroscópio como uma mancha escura clara cercada por um crescente branco. Incubar os animais a 20 °C durante 24-40 h.
6. Após a incubação, aplique OP50 na picareta e transfira ~ 3 dos vermes para uma placa NGM não semeada, deixando uma pequena quantidade de comida para trás para os vermes se alimentarem durante a imagem. Garanta comida suficiente, pois pouca comida bacteriana incentivará os vermes a se afastarem do centro do prato, enquanto muita comida aumentará a fluorescência de fundo e causará hipóxia.
7. Use uma espátula plana e arredondada para cortar um pedaço de ~ 20 mm x 20 mm da placa que carrega as minhocas e transfira o pedaço com a face para baixo no centro de uma lamínula limpa de 24 mm x 60 mm # 1,5 (Figura 1). Inicie a aplicação de um lado para evitar que as bolhas fiquem presas sob a lamínula e interfiram na imagem. Aplique uma lamínula # 1 de 22 mm x 22 mm na parte superior do pedaço para reduzir a aderência e a evaporação.

2. Configuração de hardware e instrumentação

1. Coloque os vermes transgênicos em estágio no estágio de um microscópio invertido com uma objetiva de 20x de abertura numérica de ≥ 0,7, estágio XY motorizado controlável com um joystick, um divisor de imagem e filtros de fluorescência para excitação e emissão simultâneas de GCaMP5 e mCherry, câmeras para imagens de fluorescência e campo claro infravermelho e um sistema de iluminação de diodo emissor de luz (LED) acionável (Figura 2A).
   NOTA: Um divisor de feixe 80/20 envia 80% do sinal de imagem para a câmera de fluorescência e 20% para a câmera de campo claro. Um microscópio vertical também pode ser usado, mas o pedaço NGM deve ser colocado entre uma lâmina de vidro e a lamínula grande neste caso.
   1. Use as oculares binoculares para selecionar um verme para a imagem. Quando um animal for selecionado, deslize o filtro infravermelho no lugar acima do condensador.
2. Gatilhos de lógica transistor-transistor (TTL)
   1. Conecte cabos coaxiais de cada uma das três linhas de saída de disparo TTL na câmera de fluorescência. Conecte a primeira saída à entrada BNC #3 do sistema de iluminação LED.
   2. Conecte a segunda saída a um adaptador BNC 'banana' com fios verdes e marrons do conector GPIO de 8 pinos que liga à entrada GPIO #3 (pino 4) e terra (pino 5) da câmera infravermelha, respectivamente.
   3. Conecte a terceira saída a um adaptador BNC 'banana' com fios jumper passando para a entrada digital #8 e aterramento no dispositivo de aquisição digital (Figura 2B).
3. Dispositivo de aquisição digital (DAQ)
   1. Conecte a placa do microcontrolador DAQ (consulte Tabela de materiais) ao PC por meio de um cabo USB. Atualize o firmware com o protocolo Firmata padrão (consulte a Tabela de Materiais) e configure a porta USB para se comunicar a 57600 bauds.
4. Leds
   1. Execute o software do controlador de LED (consulte a Tabela de Materiais). Mude o modo de disparo de 'Contínuo' para 'fechado' e selecione o canal de disparo '3' para os LEDs de 470 e 590 nm.
   2. Ligue e insira a alimentação do LED para cada LED (por exemplo, defina o LED de 470 nm para 20% e o LED de 590 nm para 40%).
5. Execute o script de comunicação em estágio serial 'XY-stage-final' em Bonsai (consulte a Tabela de Materiais). Clique no nó cinza 'CsvWriter' e selecione uma pasta para salvar as informações dos estágios X e Y gravados (Figura 3). Pressione a ponta de seta verde na barra de ferramentas para inicializar o DAQ.
   nota: O script começará a gravar a posição do estágio X e Y quando a câmera de fluorescência enviar um sinal TTL. Esse script gera quatro colunas de dados: número do quadro, posição X (μm), posição Y (μm) e o intervalo entre os quadros (s).
6. No software de gravação da câmera infravermelha (consulte Tabela de materiais), em 'Modos de vídeo personalizados', selecione "Modo 1" (binning 2 x 2; 1.024 x 1.024 pixels) e "Pixel Format Raw 8". Em 'Trigger / Strobe', defina a linha de entrada do gatilho (GPIO) para "3", a polaridade para "High" e o 'Mode' para "14". Alterne 'Ativar' para interromper a aquisição de quadros até que um sinal de disparo TTL seja recebido.
   1. Deixando essa janela aberta, clique no botão vermelho "Gravar" na barra de ferramentas principal da visualização da câmera. Selecione a pasta para as sequências de imagens a serem salvas. Selecione o modo de gravação 'Buffered' e salve 'Images' no formato JPEG. Clique em "Iniciar gravação" para inicializar a aquisição.
7. Câmera de fluorescência e divisor de imagem
   nota: Os canais de fluorescência GCaMP5 e mCherry devem ser coletados simultaneamente para garantir o registro adequado da imagem para quantificação raciométrica. Um divisor de imagem permite a aquisição de dois canais da fluorescência GCaMP5 e mCherry em um sensor.
   1. Na guia 'Capturar' do software de aquisição de imagem (consulte Tabela de materiais), defina o tempo de exposição para 10 ms, binning para 4x e profundidade da imagem para 16 bits. Selecione uma submatriz de câmera centralizada de 512 pixels de largura por 256 pixels de altura. Clique em 'Mostrar opções de gatilho de saída' e defina todos os gatilhos como 'Positivo'
      NOTA: O DAQ pode ocasionalmente perder gatilhos TTL se eles forem de 10 ms ou menos.
   2. Certifique-se de que 'Gatilho 1' e 'Gatilho 2' estejam definidos como 'Exposição' enquanto 'Gatilho 3' esteja definido como 'Programável' com um 'Período' de 25 ms. Na guia 'Sequência', selecione 'Lapso de tempo' com um 'Atraso de campo1' de 50 ms para coletar imagens a 20 Hz. Selecione 'Salvar em buffer temporário'.
8. Ganho de PMT e intensidade do laser durante imagens confocais de três canais
   1. Defina o ganho PMT para que a fluorescência de fundo fique em um nível logo acima do mínimo (nível de preto). Aumente a potência do laser de 561 nm (verde) até que um único pixel saturado de 12 bits ou 16 bits seja observado no terminal pré-sináptico no canal mCherry.
   2. Ajuste a intensidade do laser de 488 nm (azul) para que a fluorescência do GCaMP5 seja visível apenas no terminal pré-sináptico acima do fundo. Essa configuração baixa evita a saturação dos pixels GCaMP5 quando a fluorescência aumenta em resposta a fortes transientes de Ca²⁺. Abra o orifício confocal totalmente para maximizar a captura de luz.

3. Imagem Raciométrica de Ca²⁺ e Registro de Comportamento

1. Na guia 'Sequência' no software de aquisição de fluorescência, clique em "Iniciar" para iniciar a gravação. Rastreie o verme com o joystick, mantendo a(s) célula(s) e sinapses de interesse em foco e no centro do campo de visão (FOV). Clique no botão 'Estatísticas' na janela do histograma para mostrar as estatísticas de pixel de cada canal.
2. Ajuste a potência do LED para garantir uma fluorescência mCherry máxima de pixel único no terminal pré-sináptico de ≥ 8.000 contagens (~ 4.000 fotoelétrons), dando uma faixa dinâmica de ~ 12 bits acima do fundo (~ 100 fotoelétrons). Os sinais GCaMP5 no terminal pré-sináptico durante o repouso (baixo) Ca²⁺ devem estar em torno de ~ 2.500 contagens - apenas visíveis acima do fundo.
3. Registre até que um estado ativo de postura de ovos seja alcançado; normalmente, isso ocorre a cada 20-30 minutos em um verme do tipo selvagem. Salve um subconjunto de 10 minutos (12.001 quadros), 6.000 quadros antes e depois do primeiro evento de postura (quadro 6.001). Certifique-se de manter o mesmo subconjunto de imagens de campo claro do comportamento do worm e pontos de tempo da posição do estágio XY, ou a sincronização precisa dos fluxos de dados será perdida.
4. Use o ImageJ e o plug-in BioFormats (consulte Tabela de materiais) para converter sequências de imagens para o formato Image Cytometry Standard (.ics) para que possam ser importadas para o software Ratiometric Quantitation.

Resultados

Figura 1. Técnica de montagem de C. elegans para imagens de alta resolução da atividade e comportamento do circuito de postura de ovos.Topo, a montagem final do lado. Abaixo, a montagem final vista através da parte inferior da lamínula grande. As setas indicam alimento bacteriano OP50, vermes C. elegans e ovos, imprensados entre o pedaço de ágar NGM e a lamínula gra...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Crescimento, cultivo e montagem de C. elegans
Cepa bacteriana de Escherichia coli, OP50	Centro Genético Caenorhabditis	OP50	Alimento para C. elegans. Uracila auxotrófica. E. coli B. Nível de biossegurança 1
Estirpe de minhoca HSN GCaMP5+mCherry	Centro Genético Caenorhabditis	LX2004	Transgene integrado usando o promotor nlp-3 para conduzir a expressão de GCaMP5 e mCherry em HSN. Genótipo completo: vsIs183 [nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X
Cepa mutante LITE-1 (CE314), LIN-15 (N765TS) para preparação de transgenes	autor	LX1832	Cepa para recuperação de transgenes de alta cópia após microinjeção com plasmídeo de resgate pL15EK lin-15 (n765ts). Também possui a mutação lite-1 (ce314) ligada que reduz a sensibilidade à luz azul. Disponível a partir do autor mediante solicitação
plasmídeo de resgate genômico pL15EK lin-15a/b	autor	pL15EK	Plasmídeo de resgate para recuperação de animais transgênicos após injeção em LX1832 lite-1 (ce314), lin-15 (n765ts) X tensão. Disponível a partir do autor mediante solicitação
plasmídeo pKMC299	autor	pKMC299	Plasmídeo para expressão de mCherry nas HSNs do promotor nlp-3. Tem nlp-3 3' região não traduzida
plasmídeo pKMC300	autor	pKMC300	Plasmídeo para expressão de GCaMP5 nas HSNs do promotor nlp-3. Tem nlp-3 3' região não traduzida
Fosfato de potássio monobásico	sigma	Pág. 8281	Para preparação de placas NGM
Fosfato de potássio dibásico	sigma	Pág. 5655	Para preparação de placas NGM
Sulfato de magnésio heptahidratado	Amresco	662	Para preparação de placas NGM
Cloreto de cálcio di-hidratado	Alfa Aesar	Rolamento 12312	Para preparação de placas NGM
Peptona	Becton Dickinson	Rolamento 211820	Para preparação de placas NGM
cloreto de sódio	Amresco	241	Para preparação de placas NGM
colesterol	Alfa Aesar	A11470	Para preparação de placas NGM
Ágar Bacteriológico Tipo A, Ultrapuro	Affymetrix	Rolamento 10906	Para preparação de placas NGM
Placas de Petri de 60 mm	VWR	Rolamento 25384-164	Para preparação de placas NGM
24 x 60 mm micro óculos de cobertura, #1.5	VWR	Rolamento 48393-251	Vidro de cobertura através do qual os vermes são fotografados
Óculos de cobertura micro de 22 x 22 mm, #1	VWR	Nº 48366-067	Vidro de cobertura que cobre a parte superior do pedaço de ágar
Estereomicroscópio com base de luz transmitida	Leica	M50	Microscópio de dissecação para manutenção, preparação e montagem de cepas de vermes
Fio de irídio de platina, (80:20), 0,2 mm	ALFA AESAR	AA39526-BW	Para transferência de sem-fim
Microscópio de imagem de cálcio
Mesa de ar antivibração	TMC	Telefone: 63-544	Mesa de laboratório Micro-g' Mesa antivibração de 30" x 48" com CleanTop M6 de 4" no tampo de 25 mm
Microscópio composto invertido	Zeiss	Rolamento 431007-9902-000	Microscópio invertido Axio Observer.Z1
Sideport L80/R100 (3 posições)	Zeiss	Rolamento 425165-0000-000	Para desviar 20% da saída para a câmera de campo claro (CMOS), 80% para a câmera de fluorescência (sCMOS)
Suporte de iluminação inclinado para trás	Zeiss	Rolamento 423920-0000-000	Para imagens infravermelhas/comportamentais
Carcaça 12V/100W c/ Coletor	Zeiss	Rolamento 423000-9901-000	Para imagens infravermelhas/comportamentais
Lâmpada halógena 12V/100W	Zeiss	Rolamento 380059-1660-000	Para imagens infravermelhas/comportamentais. Os LEDs de luz branca não emitem luz infravermelha significativa, portanto, não permitirão imagens de campo claro após o filtro passa-banda infravermelho
Filtro passa-banda infravermelho de 32 mm (750-790 nm) para lâmpada halógena	Zeiss	Rolamento 447958-9000-000	BP 750-790; DMR 32mm, para iluminação infravermelha para campo claro e comportamento
Torre do condensador de 6 filtros (LD 0,55 H/DIC/Ph), motorizada	Zeiss	Rolamento 424244-0000-000	Para imagens infravermelhas/comportamentais
Condensador & Obturador	Zeiss	Rolamento 423921-0000-000	Para imagens infravermelhas/comportamentais
Ocular binocular com fototubo para câmera CMOS infravermelha	Zeiss	Rolamento 425536-0000-000	Para imagens infravermelhas/comportamentais
Ocular 10x, 23mm	Zeiss	Rolamento 444036-9000-000	Para localização de worms no pedaço de ágar
Adaptador C-Mount 2/3" 0.63x demagnifier	Zeiss	Rolamento 426113-0000-000	Montagem para câmera CMOS infravermelha
Câmera CMOS para campo claro infravermelho e comportamento (sensor de 1")	FLIR (anteriormente Point Grey Research)	GS3-U3-41C6NIR-C	Câmera para imagens de campo claro
Placa controladora de host USB 3.0	FLIR (anteriormente Point Grey Research)	ACC-01-1202	Fresco FL1100, 4 portas
8 pinos, cabo GPIO de 1m, conector circular Hirose HR25	FLIR (anteriormente Point Grey Research)	ACC-01-3000	Cabo para acionamento TTL. O fio verde se conecta ao GPIO3 / Pino 4 e o fio marrom se conecta ao Terra / Pino 5
Plano Apocromático 20x/0,8 WD=0,55 M27	Zeiss	Nº 420650-9901-000	Melhor combinação de ampliação, abertura numérica e distância de trabalho
Torre Refletora de 6 cubos, Motorizada	Zeiss	Rolamento 424947-0000-000	Para imagens de fluorescência
Trem de luz de fluorescência, motorizado	Zeiss	Rolamento 423607-0000-000	Para imagens de fluorescência
Obturador de fluorescência	Zeiss	Rolamento 423625-0000-000	Para imagens de fluorescência
Cubo de filtro de emissão e excitação dupla GFP e mCherry (para microscópio)	Zeiss	Nº 489062-9901-000	Conjunto de filtros FL 62 HE BFP+GFP+HcRed para imagens de fluorescência
Sistema de iluminação LED	Zeiss	Rolamento 423052-9501-000	Sistema LED Colibri.2 acionável para iluminação fluorescente
Módulo LED GFP (470 nm)	Zeiss	Nº 423052-9052-000	LED Colibri.2 para excitação de fluorescência GFP
Módulo LED mCherry (590 nm)	Zeiss	Nº 423052-9082-000	LED Colibri.2 para excitação de fluorescência mCherry
Controle deslizante de parada de íris para equipamentos de luz incidente	Zeiss	Nº 000000-1062-360	Abertura de campo íris para limitar a iluminação LED ao campo de visão da câmera
Adaptador de montagem em C 1" 1.0x	Zeiss	Rolamento 426114-0000-000	Adaptador para divisor de imagem e câmera de fluorescência sCMOS
Divisor de imagem	Hamamatsu	A12801-01	Gemini W-View, outros divisores de imagem podem ser usados, mas podem não ser otimizados para o grande tamanho do sensor das câmeras sCMOS
Espelho dicróico GFP / mCherry (divisor de imagem)	Semrock	Di02-R594-25x36	Dividindo GCaMP5 de mCherry e sinais infravermelhos
Filtro de emissão GFP (divisor de imagem)	Semrock	FF01-525/30-25	Capturando a fluorescência GCaMP5
mCherry/filtro de emissão (divisor de imagem)	Semrock	FF01-647/57-25	Este filtro é necessário para excluir a luz infravermelha usada para imagens de campo claro
câmera sCMOS para fluorescência (sensor de 1")	Hamamatsu	A12802-01 / C11440-22CU	Orca FLASH 4.0 V2. Os modelos mais recentes permitem configurações separadas de aquisição de imagem em metades separadas do sensor, permitindo a aquisição de imagens de dois canais em combinação com um divisor de imagem
Estágio XY motorizado	Märzhäuser	DIGITALIZAR IM 130 x 100	Movimento do estágio; a resolução XY deste estágio é de 0,2 μm por passo
Controlador de palco XY com joystick	RISOS	MAC6000, joystick XY	Rastreamento manual de vermes. MAC6000 controlador deve ser conectado ao PC através da porta serial (RS-232) configurada para 115200 baud
Placa de aquisição digital (DAQ)	Arduino	ONU	Recebendo gatilhos TTL da câmera sCMOS. O Uno deve ser carregado com o pacote Firmata padrão e a porta USB do computador configurada para 57600 baud
Cabo BNC Macho para BNC Macho - 6 pés	Tecnologia Hosa	HOBB6	Conectores BNC para acionamento TTL
Cabo coaxial BNC macho para SMA macho banhado a ouro (8,8")	uxcell	6.08642E+11	Para conectar as saídas de disparo da câmera de fluorescência
Adaptador de cabeça giratória BNC	Hantek	RRBNCTH21	Adaptador BNC para plugue banana (4 mm)
Conector BNC fêmea para fêmea	Diageng	20130530009	Adaptador BNC fêmea para fêmea para conectar a saída BNC da câmera ao plugue Banana
Fios jumper de placa de ensaio flexíveis sem solda	Z&T	GK1212827	Para conectar as saídas de disparo BNC ao Arduiono DAQ.
Estação de trabalho de alto desempenho	Hp	Z820	Windows 7, 64 GB de RAM, processador Dual Xeon, unidade C: de estado sólido, porta serial (RS-232), vários slots PCIe3 para conectividade Ethernet, placas USB 3.0 e unidades de estado sólido adicionais
Unidade de estado sólido M.2	Samsung	MZ-V5P512BW	Streaming de alta velocidade e análise de dados de imagem
Adaptador de unidade de estado sólido M.2 para estações de trabalho	Lycom	DT-120	Adaptador de 4 pistas M.2 para PCIe 3.0
Armazenamento conectado à rede	Synology	DS-2415+	Armazenamento e análise de dados de imagem
Unidades de disco rígido	Western Digital	WD80EFZX	RED 8 TB, 5400 RPM Classe SATA 6 Gb/s 128MB Cache 3.5 Polegadas. Armazenamento de dados de imagem (10 unidades + 2 redundância de unidades)
software
Aquisição de fluorescência	Hamamatsu	HCImage DIA	Gravação de sequências de imagens de fluorescência de dois canais (GCaMP5 e mCherry) a 20 fps
Aquisição da Brightfield	FLIR (anteriormente Point Grey Research)	Captura de mosca	Gravação de sequências de imagens JPEG de campo claro
Leitor de porta serial de palco	bonsai	https://bitbucket.org/horizongir/bonsai	Facilita o rastreamento de worms durante o comportamento
Software do controlador de LED	Zeiss	Teste de Micro Caixa de Ferramentas 2011	Para configurar a intensidade e as entradas de disparo para os diferentes LEDs na unidade Colibri.2
ImagemJ	Nih	https://imagej.net/Fiji/Downloads	Revisão simples de sequências de imagens e alterações de formatação para importação para o software Ratiometric Quantitation
distinguir-se	Microsoft	2002984-001-000001	Para gerar subconjuntos de dados de valores separados por vírgula da Volocity para análise MATLAB
Descoberta de pico	LABORATÓRIO MATLAB	R2017a	Script usado para cálculos de recursos de pico de proporção
Quantificação Raciométrica	Perkin Elmer	Volocidade 6.3	Facilita o cálculo de canais de imagem raciométricos, segmentação de imagem para localização de objetos e medição de proporção de objetos encontrados
Scripts
AnalyzeGCaMP_2017 da manhã	LABORATÓRIO MATLAB	Razão média e script centróide XY	Analisa uma saída raciométrica em formato .csv, consolidando objetos e posições centróides, calculando mudanças de razão (ΔR/R), identificando picos e feições de pico e escrevendo gráficos (com e sem picos anotados) em formato postscript. Para importação de arquivo de matriz, o script enviará dados em três pastas: analisado, picos e rastreamentos. A saída 'Analisada' é um arquivo matricial dos objetos consolidados com seis colunas (unidades): tempo (s), área (mícrons quadrados), razão, centróide X (mícrons), centróide Y (mícrons) e ΔR/R. A saída 'Picos' é um arquivo matricial dos pontos de tempo dos picos encontrados, a amplitude (em ΔR/R), a largura (s) do pico (s), e a proeminência do pico. A saída de 'traços' são arquivos postscript de traços de cálcio.
XY-estágio-final.bonsai	bonsai	DAQ acionado por TTL e leitor de porta serial de posição de platina	Registra a posição do estágio X e Y (em mícrons) quando o Arduino conectado recebe um sinal TTL positivo da câmera sCMOS durante a exposição do quadro. O script grava um arquivo .csv com quatro colunas: número do quadro, posição X (mícrons), posição Y (mícrons) e o tempo decorrido entre os quadros (normalmente ~50 ms ao gravar a 20 fps). A posição do estágio X e Y dessa saída (colunas 2 e 3, respectivamente) é adicionada às posições do centróide X e Y do AnalyzeGCaM