Registrando oscilações de banda gama de neurônios do núcleo pedunculopontino em uma fatia de cérebro

Resumo

Fonte: Urbano, F. J., et al. Registrando oscilações de banda gama em neurônios do núcleo pedunculopontino. J. Vis. Exp. (2016).

O vídeo demonstra o método para registrar oscilações de banda gama em neurônios PPN. Usando uma seção cerebral sagital com bloqueadores sinápticos em aCSF, ele emprega pulsos de corrente positiva por meio de uma pipeta para abrir os canais de cálcio, induzindo atividade subliminar crucial para a vigília.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação do líquido cefalorraquidiano artificial padrão (aCSF)

1. Preparação da solução-mãe A
   1. Adicione 700 ml de água destilada a um copo limpo de 1 L antes de adicionar produtos químicos.
   2. Enquanto agita continuamente um volume de 500 ml, adicione 136,75 g de NaCl, 6,99 g de KCl, 2,89 g de MgSO₄ e 2,83 g de NaH₂PO₄.
   3. Adicione mais água destilada para atingir um volume final de 1 L. Após a diluição, a concentração final de cada composto é de 117 mM de NaCl, 4,69 mM de KCl, 1,2 mM de MgSO₄ e 1,18 mM de NaH₂PO₄.
   4. Manter refrigerado a 4 °C por até 2 semanas.
2. Preparação da solução estoque B
   1. Adicione 700 ml de água destilada a um copo limpo de 1L antes de adicionar produtos químicos.
   2. Enquanto mexe continuamente um volume de 500 ml, adicione 41,45 g de D-glicose e 41,84 g de NaHCO₃.
   3. Adicione mais água destilada para atingir um volume final de 1 L. Após diluição, a concentração final de cada composto é de 11,5 mM de D-glicose e 24,9 mM de NaHCO₃.
   4. Manter refrigerado a 4 °C por até 2 semanas.
   5. Antes de cada experiência, misturar 50 ml de caldo A com 50 ml de caldo B e levar a 1 L com água destilada para obter a concentração final da solução de aCSF e deixar em RT enquanto oxigena continuamente com carbogénio (mistura de 95% O₂ - 5% de CO₂) durante pelo menos 30 min. Preparar a concentração final de aCSF apenas no início de cada experiência e rejeitar no final do dia.

2. Preparação de líquido cefalorraquidiano artificial com sacarose (sacarose-aCSF)

1. Preparação da solução estoque C
   1. Adicione 700 ml de água destilada a um copo limpo de 1 L antes de adicionar produtos químicos.
   2. Enquanto mexe continuamente 500 ml de água destilada, adicione 240 g de sacarose, 6,55 g de NaHCO₃, 0,671 g de KCl, 4,88 g de MgCl₂, 0,22 g de CaCl₂ e 0,21 g de ácido ascórbico.
   3. Adicione mais água destilada para atingir um volume final de 1 L. Após diluição, a concentração final de cada composto é de 701,1 mM de sacarose, 78 mM de NaHCO₃, 9 mM de KCl, 24 mM de MgCl₂, 1,5 mM de CaCl₂ e 1,2 mM de ácido ascórbico.
   4. Conservar a solução C a 4 °C durante uma semana.
   5. Antes de cada experiência, misturar 300 ml de 50 ml de C-reserva com 600 ml de água destilada para obter a solução de sacarose-aCSF na concentração final. Deixe em RT enquanto oxigena continuamente com carbogênio (mistura de 95% O₂ - 5% CO₂) por pelo menos 30 min.

3. Preparação da fatia

1. Colocar um copo limpo com 100 ml de solução de sacarose-aCSF no gelo, oxigenando-o com carbogénio, e fixar o pH em 7,4 utilizando um medidor de pH, adicionando algumas gotas de solução de NaOH 0,1 M (quando o pH < 7,4) ou de HCl 0,1 M (quando o pH > 7,4).
2. Encha uma câmara de corte de um vibratomo com sacarose-aCSF e oxigene-o. Ligue o sistema de refrigeração à base de glicerol acoplado à câmara de corte e aguarde 15 min para permitir que esfrie até 0 - 4 °C.
3. Anestesiar filhotes de ratos (de 9 a 12 anos de ratos Sprague-Dawley adultos com gravidez programada) com cetamina (70 mg / kg, i.p.; usando < volume final de 50 μl). Quando o filhote estiver calmo, verifique novamente se o reflexo de pinça da cauda está ausente.
4. Decapitar filhotes.
   1. Corte a pele da cabeça longitudinalmente da frente para trás usando uma lâmina de bisturi de aço carbono e puxe a pele para os lados usando uma pinça. Corte o osso que cobre o cérebro, mova a tesoura lateralmente e remova-a totalmente para expor o cérebro.
   2. Em seguida, remova rapidamente o cérebro usando uma espátula (inicialmente colocada sob o bulbo olfatório para empurrá-lo suavemente da área mais rostral para a mais caudal). Empurre suavemente o cérebro para o líquido cefalorraquidiano artificial de sacarose oxigenada resfriado com gelo (sacarose-aCSF).
5. Faça um corte parassagital no hemisfério direito (removendo aproximadamente um terço do hemisfério) e cole o lado aparado do cérebro em um disco metálico que será fixado magneticamente à câmara de corte de um vibroslicador para cortar cortes sagitais de 400 μm contendo o núcleo pedunculopontino (PPN). Mantenha as fatias de PPN em RT por 45 minutos antes das gravações de patch clamp de célula inteira.

4. Gravações de oscilações de banda gama em fatias PPN

1. Preparação de solução intracelular de gluconato de potássio (solução com alto teor de K +)
   1. Colocar no gelo um copo limpo com 10 ml de água destilada. Enquanto mexe continuamente, adicione: K+-gluconato, 90,68 mg de fosfocreatina di sal de Tris, 47,66 mg de HEPES, 1,5 mg de EGTA, 40,58 mg de Mg²⁺-ATP e 4 mg de Na⁺_2-GTP.
   2. Ajuste o pH para 7,3 com KOH (100 mM em água destilada). Adicione água destilada até atingir um volume final de 20 mL. Se necessário, ajuste a osmolaridade com sacarose (100 mM em água destilada) para 280 - 290 mOsm. Após diluição, a concentração final de cada composto é 124 mM de gluconato de K+, 10 mM de fosfocreatina di Tris sal, 10 mM de HEPES, 0,2 mM de EGTA, 4 mM de Mg^{de 2+}-ATP e 0,3 mM de Na⁺_2-GTP.
   3. Alíquota de soluções intracelulares em tubos de 1 ml e congelar a -20 °C. Utilizar uma alíquota por dia e manter a 4 °C durante as experiências.
2. Gravações de grampo de patch de célula inteira
   1. Coloque as fatias em uma câmara de imersão e perfunda-as (1,5 ml/min) com aCSF oxigenado (95% O₂ - 5% CO₂) contendo os seguintes antagonistas dos receptores: antagonista seletivo do receptor NMDA 2-amino-5-ácido fosfonovalérico (APV, 40 μM), antagonista competitivo do receptor de glutamato AMPA/Cainato 6-ciano-7-nitroquinoxalina-2,3-diona (CNQX, 10μM), antagonista do receptor de glicina estricnina (STR, 10 μM), o antagonista específico do receptor GABA_A gabazina (GBZ, 10 μM) e o bloqueador dos canais de sódio tetrodotoxina (TTX, 3μM)
      Encha as pipetas de registro (resistência 2-7 MΩ; feitas de capilares de vidro borossilicato de parede espessa regulares e disponíveis comercialmente de 1,0 mm de diâmetro externo e 0,6 mm de diâmetro interno) com solução intracelular de alto K+ usando enchimentos de pipeta de adesivo disponíveis comercialmente com um filtro de solução. Insira a pipeta em seu suporte do amplificador. Aplique uma pequena pressão positiva usando uma seringa de 1 ml conectada ao porta-pipetas usando um tubo de silicone conectado a uma válvula de três vias. Conecte a parte traseira do porta-pipeta a um patch clamp amplificador.
   2. Mova a pipeta de gravação usando um micromanipulador mecânico próximo ao núcleo PPN usando uma objetiva 4X combinada com óptica de contraste de interferência diferencial de infravermelho próximo.
      nota: O núcleo PPN pode ser observado em fatias dorsais ao pedúnculo cerebelar superior (SCP; observável como um feixe espesso de axônios). As pipetas de registro foram localizadas na pars compacta do PPN, que está localizada imediatamente dorsal à extremidade posterior do pedúnculo.
   3. Coloque a pipeta de gravação em contato com um neurônio PPN enquanto visualizado usando uma lente de imersão em água 40X e aplique rapidamente sucção negativa para formar uma vedação com a célula.
   4. Use o software de vedação de grampo de tensão para monitorar a resistência da pipeta durante a sucção negativa usando o protocolo do fabricante.
      1. Quando a sucção negativa é aumentada lentamente e os valores de resistência lidos pelo monitor patch-clamp na ponta da pipeta atingem 80 - 100 MOhm, altere rapidamente o potencial de retenção para -50 mV e libere a pressão negativa. Comece a aplicar continuamente a sucção negativa até romper a membrana do neurônio e o acesso elétrico ser alcançado na configuração de toda a célula.
      2. Se os valores de resistência de acesso medidos pelo software de vedação de grampo de tensão forem 10 MOhm ou mais, continue aplicando sucção negativa em quantidades menores.
   5. Compense a capacitância (ou seja, transientes lentos e rápidos observados após a ruptura da membrana da célula) e a resistência em série no modo de grampo de tensão. Mude o modo de gravação para o grampo atual e compense rapidamente os valores da ponte (por exemplo, mova o botão do amplificador ou clique no menu de compensação automática usando o mouse do computador).
      1. Monitore continuamente o potencial de membrana em repouso do neurônio PPN sendo registrado usando o protocolo do fabricante. Se o potencial da membrana em repouso mudar para valores despolarizantes ou hiperpolarizantes, use pequenas quantidades de corrente contínua (até 100 pA) para manter o valor final ideal de -50 mV.
         nota: Mantenha apenas os neurônios PPN com um potencial de membrana em repouso estável (RMP) de -48 mV ou mais hiperpolarizado (ou seja, RMP < -48 mV).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
sacarose	Sigma-Aldrich	S8501	C12H22O11, peso molecular = 342,30
bicarbonato de sódio	Sigma-Aldrich	S6014	NaHCO3, peso molecular = 84,01
Cloreto de potássio	Sigma-Aldrich	Pág. 3911	KCl, peso molecular = 74,55
Cloreto de magnésio hexahidratado	Sigma-Aldrich	M9272	MgCl2 · 6H2O, peso molecular = 203,30
Cloreto de cálcio di-hidratado	Sigma-Aldrich	C3881	CaCl2 · 2H2O, peso molecular = 147,02
D-(+)-Glicose	Sigma-Aldrich	G5767	C6H12O6, peso molecular = 180,16
Ácido L-ascórbico	Sigma-Aldrich	Rolamento A5960	C6H8O6, peso molecular = 176,12
cloreto de sódio	Acros Orgânicos	327300025	NaCl, peso molecular = 58,44
Gluconato de potássio	Sigma-Aldrich	G4500	C6H11KO7, peso molecular = 234,25
Sal de fosfocreatina di(tris)	Sigma-Aldrich	Pág. 1937	C4H10N3O5P · 2C4H11NO3, peso molecular = 453,38
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	C8H18N2O4S, peso molecular = 238,30
EGTA	Sigma-Aldrich	E0396	[-CH2OCH2CH2N(CH2CO2H)2]2, peso molecular = 380,40
Sal de adenosina 5'-trifosfato de magnésio	Sigma-Aldrich	Resposta A9187	C10H16N5O13P3 · xMg2+, peso molecular = 507,18
Guanosina 5'-trifosfato de sódio sal hidratado	Sigma-Aldrich	G8877	C10H16N5O14P3 · xNa+, peso molecular = 523,18
Citrato de tetrodotoxina	Laboratórios Alomone	T-550	C11H17N3O8, peso molecular = 319,27
Ácido DL-2-amino-5-fosfonovalérico	Sigma-Aldrich	Resposta 5282	C5H12NO5P, peso molecular = 197,13
CNQX hidrato de sal dissódico	Sigma-Aldrich	C239	C9H2N4Na2O4 · xH2O, peso molecular = 276,12
estricnina	Sigma-Aldrich	S0532	C21H22N2O2, peso molecular = 334,41
Cloridrato de mecamilamina	Sigma-Aldrich	M9020	C11H21N · HCl, peso molecular = 203,75
Gabazina (SR-95531)	Sigma-Aldrich	S106	C15H18BrN3O3, peso molecular = 368,23
Cloridrato de cetamina	Mylan	Nº 67457-001-00
microscópio	Nikon	Eclipse E600FN
Micromanipulador	Instrumentos Sutter	ROE-200
Micromanipulador	Instrumentos Sutter	MPC-200
amplificador	Dispositivos Moleculares	Grampo múltiplo 700B
Conversor A/D	Dispositivos Moleculares	Digidata 1440A
aquecedor	Warner Instruments	TC-324B
bomba	Cole-Parmer	Masterflex L/S 7519-20
Cartucho da bomba	Cole-Parmer	Masterflex 7519-85
Extrator de pipetas	Instrumentos Sutter	Pág. 97
câmera	Q-Imagem	RET-200R-F-M-12-C
Vibratomo	Leica Biosystems	Leica VT1200 S
Sistema de refrigeração	Instrumentos Vibratome	900R
equipamento
microscópio	Nikon	Eclipse E600FN
micromanipulador	Instrumentos Sutter	ROE-200
micromanipulador	Instrumentos Sutter	MPC-200
amplificador	Dispositivos Moleculares	Grampo múltiplo 700B
Conversor A/D	Dispositivos Moleculares	Digidata 1440A
aquecedor	Warner Instruments	TC-324B
bomba	Cole-Parmer	Masterflex L/S 7519-20
cartucho da bomba	Cole-Parmer	Masterflex 7519-85
extrator de pipetas	Instrumentos Sutter	Pág. 97
câmera	Q-Imagem	RET-200R-F-M-12-C