Uso de uma armadilha óptica de Estudos de Interações Hospedeiro-Patógeno para imagens de células dinâmica ao vivo

Summary

Um método é descrito para selecionar individualmente, manipular e patógenos imagem ao vivo usando uma armadilha óptica acoplada a um microscópio disco giratório. A armadilha óptica fornece controle espacial e temporal dos organismos e os coloca ao lado células hospedeiras. Microscopia de fluorescência captura dinâmica interações intercelulares com perturbação mínima para as células.

Abstract

Imagens de células ao vivo dinâmica permite a visualização direta de tempo-real interações entre as células do sistema imunitário ^{1, 2,} no entanto, a falta de controle espacial e temporal entre a célula fagocítica e micróbio tornou foco observações sobre a interação inicial de resposta do hospedeiro a patógenos difícil. Historicamente, os eventos de contato intercelular tais como fagocitose ³ foram fotografadas pela mistura de dois tipos de células, e depois continuamente digitalização do campo de visão para encontrar serendipitous contatos intercelulares no estágio apropriado de interação. A natureza estocástica desses eventos torna este processo tedioso, e é difícil de observar eventos cedo ou fugazes em contato célula-célula por esta abordagem. Este método requer encontrar pares de células que estão à beira de contato, e observá-los até que entre em contato com consumado, ou não. Para lidar com essas limitações, nós usamos a captura óptica como um método não invasivo, não-destrutivo, mas rápido e eficaz para a posição células em cultura.

Armadilhas ópticas, ou pinças ópticas, estão cada vez mais utilizados em pesquisa biológica para capturar e manipular fisicamente as células e outros micro-empresas partículas em três dimensões ^4. Pressão de radiação foi observada pela primeira vez e aplicada a sistemas de pinça óptica em 1970 ^{5, 6,} e foi usado pela primeira vez para controlar espécimes biológicos em 1987 ^7. Desde então, a pinça óptica amadureceram em uma tecnologia para sondar uma variedade de fenômenos biológicos ^13/08.

Nós descrevemos um método de ¹⁴ que avanços ao vivo imagens de células através da integração de uma armadilha óptica com spinning microscopia confocal de disco com controle de temperatura e umidade para fornecer controle espacial e temporal requintada de organismos patogênicos em um ambiente fisiológico para facilitar a interação com células hospedeiras, como determinado pelo operador. Live, organismos patogênicos, como Candida albicans e Aspergillus fumigatus, que pode causar potencialmente letal, infecções invasivas em indivíduos imunocomprometidos ^{15, 16} (por exemplo, AIDS, quimioterapia e transplante de órgãos doentes), foram presos opticamente usando intensidades não-destrutivo a laser e mudou-se junto ao macrófagos, o que pode fagocitam o patógeno. De alta resolução, transmitido filmes de luz e de fluorescência baseada estabelecida a capacidade de observar os primeiros eventos de fagocitose em células vivas. Para demonstrar a ampla aplicabilidade em imunologia, principais células T também foram presos e manipulados para formar sinapses com anti-CD3 microesferas revestidas in vivo, e lapso de tempo de imagem de formação de sinapses também foi obtida. Ao fornecer um método para exercer o controle de patógenos espaciais bem viver com respeito às células imunológicas, as interações celulares podem ser capturados por microscopia de fluorescência com perturbação mínima para as células e pode render uma visão poderosa em respostas iniciais de imunidade inata e adaptativa.

Protocol

1. Condições de cultivo de patógenos para a captura óptica

1. Crescer A. fumigatus (B-5233/RGD12-8) em uma mídia semi-sólido de ágar contendo SBD (Sabouraud dextrose) a 30 ° C durante 3 dias.
2. Crescer C. albicans (SC5314) em YPD (Yeast-peptona Dextrose) de cultura líquido contendo 100 mg / mL ampicilina durante a noite em uma incubadora shaker a 30 ° C.

2. Preparação de agentes patogênicos para a rotulagem fluorescentes

1. Colheita desejada quantidade de patógenos e transferir para um tubo de reação 1,5 mL.
2. Adicionar mL 300 de tampão fosfato (PBS) ao tubo de reação.
3. Soni....

Discussion

Neste trabalho nós usamos uma armadilha óptica para capturar patógenos com dimensões entre 3 mm - 5 mm. Apesar de patógenos de interesse para o nosso laboratório normalmente têm estas dimensões, o sistema de pinça óptica aqui descrito é flexível para capturar uma grande variedade de tamanhos. Na verdade armadilhas ópticas têm sido usados ​​para capturar partículas que variam de átomos individuais para as células de aproximadamente 10 m de diâmetro. Além disso, este sistema de captura óptica foi capaz de capturar partícu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
A. fumigatus			Tensão Albino, B-5233/RGD12-8, dom de KJ Kwon-Chung, NIH
C. albicans			SSY50-B mutante, presente de Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 tensão, presente de Gerald Fink, Whitehead Institute
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A20000
Alexa Fluor 647	Invitrogen	A20006
dimetilformamida	Sigma	D4551
Sangue fresco			Dom de RJW Heath, MGH, HMS
Nikon microscópio invertido	Nikon		Modelo Ti-E
Laser de aprisionamento, ChromaLase	Pesquisa Blue Sky	CLAS-106-STF02-02
Laser de excitação de fluorescência	Coerente		Innova modelo 70C
Breadboards para componentes armadilhas	Thorlabs	MB1224, MB1218
Mesa de ar óptica	Técnico Manufacturing Corporation
Obturador eletrônico com controle de pedal	Uniblitz		Comprado de Vincent Associates, Rochester, NY
Fibra óptica monomodo	Oz Optics	PMJ-3S3S-1064-6
Posicionador de fibra	Thorlabs	PAF-X-5-C
Colimador de fibra	Oz Optics	HPUCO-23-1064-P-25AC
Lentes para o telescópio	Thorlabs	AC254-150-B	Distância focal de 150 mm
Estágios de tradução (x, y, z)	Newport	M-461-XYZ
IR dichroic espelho	Chroma	ET750-sp-2p8
Lente objetiva (100X)	Nikon		NA = 1,49, imersão em óleo, o objetivo TIRF
Cabeça confocal	Yokogawa	CSU-XI
Polarizador	Nikon	MEN51941
Wollaston prisma	Nikon	MBH76190
EM-câmera CCD	Hamamatsu	C9100-13
CCD da câmera (ORCA ER)	Hamamatsu	C4742-80-12AG
Roda de filtros	Ludl	99A353
Roda de filtros	Sutter	LB10-NWE
Chambered lamela	Lab-Tek/Nunc	155409
Dynabeads	Invitrogen	111-51D	Revestidas com anti-CD3
Meio modificado Dulbecco Águia (DMEM)	Invitrogen / Gibco	10313
Penicilina / estreptomicina	Invitrogen / Gibco	15140-122
L-glutamina	Invitrogen / Gibco	25030-081
De soro fetal bovino (HyClone)	ThermoScientific	SH30071.03