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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Fabricação de fones de ouvido com dois eletrodos bipolares (Figura 1)
- Corte 3,5 cm de fio de aço inoxidável revestido de politetrafluoretileno.
- Retire cerca de 1 mm da camada de isolamento do fio em ambas as extremidades. Não tenha muito fio descascado.
- Coloque dois pinos em um suporte de torno com a parte inferior do pino que tem uma fenda mais longa voltada para baixo.
- Aplique fluxo nas extremidades descascadas do fio e na parte superior dos pinos.
- Estanhe a parte descascada do fio com solda apenas o suficiente para revesti-lo.
- Adicione uma quantidade mínima de solda na parte superior do pino sem transbordar para as laterais.
- Coloque uma extremidade das extremidades descascadas do fio no pino o mais fundo possível enquanto a solda é derretida.
nota: Há um orifício lateral por onde o fio pode sair - não deixe o fio sair do pino. Todo o fio descascado deve ficar dentro do pino.
- Repita as etapas 1.6-1.7 para o segundo pino, agora com as outras extremidades descascadas do fio.
- Deixe os pinos assentarem por 30 s para endurecer, remova-os do suporte do torno e puxe-os para certificar-se de que a conexão entre o fio e os pinos seja forte e firme.
- Enxágue os pinos em água fria e seque.
- Verifique a condutância entre o pino 1 e o pino 2 usando um ohmímetro.
- Junte os pinos nas extremidades do fio; segure-os paralelos e próximos. Prenda um hemostato no centro do fio. Em seguida, gire o hemostático, de modo que o fio se torça com bastante força. Remova o hemostático.
- Prenda uma pinça no fio trançado 2 mm abaixo dos pinos e dobre o fio a 90°.
- Empurre o mesmo fio novamente 90° para trás sobre a pinça, criando outra dobra a 1 mm da primeira.
- Corte o fio torcido em um ângulo de 45° abaixo da dobra em 3.5 mm com uma tesoura pequena e afiada.
- Prepare dois desses eletrodos bipolares (torcidos de pino duplo) para cada fone de ouvido (opcional, o segundo é o backup em caso de problemas elétricos com o primeiro).
- Prepare um único eletrodo de referência cortando um fio com pinos soldados em ambas as extremidades em dois (etapas 1.1-1.17, Figura 1A).
- Corte o fio a 7 mm.
- Dobre a extremidade 1 mm abaixo da ponta.
- Em seguida, cubra a ponta dobrada de 1 mm do fio com uma pinça e gire o fio firmemente ao redor da pinça para criar um pequeno laço (1 mm de diâmetro).
- Dobre o laço perpendicularmente à parte reta do fio para fazer com que a ponta do fio aponte para fora novamente.
- Monte os dois eletrodos bipolares e o eletrodo de referência único no pedestal de seis pinos de forma que os eletrodos bipolares fiquem lado a lado com 6 mm de distância entre eles e que o eletrodo de referência seja colocado no orifício externo do meio (Figura 1B).
nota: Um método alternativo é implantar os eletrodos, cimentá-los no lugar e, em seguida, inserir seus pinos no pedestal.
2. Implante de eletrodo estereotáxico
- Esterilize todas as ferramentas cirúrgicas e o conjunto do eletrodo de seis pinos em autoclavagem antes da cirurgia. Um campo cirúrgico estéril deve ser mantido durante a cirurgia e luvas cirúrgicas estéreis devem ser usadas. Cortinas estéreis (por exemplo, Press n' Seal) são recomendadas para cobrir o animal, exceto na área cirúrgica.
- Use camundongos VGAT-Cre de 8 semanas de idade (expressando Cre recombinase sob o controle do gene do transportador vesicular GABA [VGAT], pareados por idade, machos e fêmeas) para cirurgias 4 semanas após o desmame. Registre o peso do animal antes da cirurgia para permitir a medição da perda de peso pós-cirúrgica.
- Use um vaporizador de isoflurano certificado ou um sistema de anestesia de baixo fluxo equipado com uma bomba de seringa de precisão, vaporizador digital integrado e almofada térmica de feedback.
nota: Os sistemas de baixo fluxo são capazes de administrar anestesia em baixas taxas de fluxo proporcionais ao tamanho do animal em uma câmara de indução ou através de um cone nasal na estrutura estereotáxica (70 mL / min, a concentração de isoflurano no ar é de 4% para indução e 2% para cirurgia). Usar menos anestesia não apenas beneficia o animal durante as cirurgias, mas também reduz o risco de exposição do pessoal do laboratório ao isoflurano.
- Coloque o animal anestesiado em uma almofada aquecida a 37 °C para mantê-lo aquecido durante a cirurgia. Se estiver usando um sistema de temperatura controlado por feedback, insira a sonda de temperatura levemente lubrificada no reto do animal para monitoramento de temperatura durante a cirurgia.
- Monte o animal na estrutura estereotáxica, colocando suavemente as barras auriculares nas orelhas e os dentes superiores frontais na barra incisiva. Coloque o cone do nariz sobre o nariz para uma administração adequada da anestesia. Certifique-se de que a cabeça esteja nivelada e centralizada e não possa ser movida quando ligeiramente sondada.
- Injete por via subcutânea 0,5 mL de normosol para hidratação.
- Aplique lubrificante ocular para evitar o ressecamento da córnea.
- Monitore a profundidade da anestesia pela ausência do reflexo de retirada após beliscar um dedo do pé do membro posterior e, em seguida, diminua o isoflurano para 1,5% a 2,0% durante a cirurgia.
- Remova os pelos na área cirúrgica e ao redor dela depilando ou usando aparadores (barbear) ou creme depilatório e desinfete a pele com três ciclos de aplicação alternada de iodo e etanol, finalizando com iodo. A remoção de pelos do local da cirurgia é recomendada apenas se houver meios para manter a anestesia nesse local. Se necessário, use aplicadores de ponta de algodão embebidos em álcool para remover os pelos da área imediata ao redor da cabeça. Injetar 0,05 mL do analgésico local bupivacaína (0,25%) por via subcutânea.
- Faça uma incisão no crânio usando um bisturi e, em seguida, corte uma parte da pele com uma tesoura cirúrgica afiada, expondo o crânio. Empurrando a pele para o lado, usando um cotonete, limpe o crânio de todos os músculos e tecidos subjacentes que obstruem a visão.
nota: Para parar o sangramento acidental, aplique pressão sobre o local do sangramento com um cotonete estéril até que ele pare.
- Limpe o crânio com peróxido de hidrogênio usando cotonetes estéreis para tornar visíveis as suturas do crânio e o bregma e o lambda.
- Seque bem o crânio e, em seguida, aplique uma gota de adesivo dental autocondicionante usando seu aplicador. Escove-o no crânio, espere 60 s e cure com uma luz UV dental por 40 s. Uma superfície brilhante indica que o adesivo foi efetivamente reticulado com o crânio.
nota: Esta etapa é crítica para a fixação segura do fone de ouvido.
- Use uma broca de 0.031" (0.79 mm) para fazer dois furos de rebarba bilateralmente para implantação de eletrodos de profundidade do hipocampo (aproximadamente 5,000 rpm). Faça um furo extra para o eletrodo de referência acima do cerebelo atrás do lambda.
NOTA: Ao perfurar, tome cuidado para abaixar a broca lentamente e evite perfurar o cérebro.
- As coordenadas para os eletrodos são as seguintes (do bregma em mm): eletrodos do hipocampo a 3 mm posterior, 3 mm lateral e 3 mm de profundidade; e eletrodo de referência cerebelar a 6 mm posterior, 0 mm lateral e 0 mm de profundidade (subdural).
- Para aumentar a precisão, use uma broca montada estereotaxicamente, zere o eixo X/Y do manipulador estereotáxico ao tocar no bregma - este é o ponto de referência para as coordenadas.
- Monte um fone de ouvido inserindo todos os eletrodos no pedestal de seis pinos, certificando-se de que os pinos estejam totalmente inseridos no pedestal. Monte o pedestal no suporte do eletrodo em uma estrutura estereotáxica (Figura 1B).
- Alinhe os eletrodos acima dos orifícios correspondentes. Implante estereotaxicamente eletrodos de fio de aço inoxidável bipolar torcido no hipocampo direito e esquerdo e eletrodo de referência no cerebelo, abaixando lentamente o fone de ouvido e guiando os eletrodos para os orifícios da rebarba.
- Quando o eletrodo de torção do hipocampo estiver logo acima do orifício, zere o eixo Z e abaixe lentamente para -3,0 mm.
- Cubra a superfície do crânio e os eletrodos com cimento dental e preencha o espaço entre a superfície do crânio e a parte inferior do pedestal. As bordas da pele serão adjacentes ao cimento dentário, de modo que nenhum tecido subjacente permaneça exposto. Espere o cimento secar e endurecer. Em seguida, retire o suporte do eletrodo do braço estereotáxico e remova o suporte do pedestal.
- Injete 0,1 mL de cetoprofeno (1 mg/mL, por via subcutânea [SC]) para analgesia e uma segunda dose de 0,5 mL de normosol (SC) para hidratação e retire o animal do quadro estereotáxico.
- Coloque uma almofada isotérmica pré-aquecida a 37 °C dentro de uma gaiola vazia coberta com uma toalha de papel. Quando estiver totalmente acordado, coloque o animal em uma gaiola limpa com roupa de cama e comida macia e devolva-o ao viveiro. Os animais são alojados individualmente a partir deste ponto para evitar mastigar os fones de ouvido uns dos outros. Os funis de barra de arame não são usados para evitar que os fones de ouvido fiquem presos e, em vez disso, as garrafas de água são amarradas na parte inferior da parte superior da gaiola e a ração está presente na roupa de cama.
- Alimente o animal com ração macia por 72 h após a cirurgia e monitore a perda de peso e o escore de condição corporal. Animais desidratados podem receber 0,5 mL de normosol por via subcutânea se desidratados (perda de peso, aumento do turgor da pele, olhos fundos). O cetoprofeno pode ser administrado por via subcutânea uma vez ao dia por mais 2 dias após a cirurgia (siga o esquema de analgesia de acordo com as diretrizes do comitê institucional local de cuidados e uso de animais [IACUC]). Permitir que os animais se recuperem totalmente em suas gaiolas por 4-7 dias antes de serem transferidos para o sistema de registro de eletroencefalografia (EEG).
