Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Preparando Solução Experimental e Equipamento para Gravação de Multieletrodos
- Prepare o líquido cefalorraquidiano artificial (líquido cefalorraquidiano artificial [aCSF]; NaCl 124 mM, KCl 4,4 mM, NaH 1mM 2PO3, MgSO4 2 mM, CaCl2 2, NaHCO3 25 mM e glicose 10 mM, borbulhado com 95% O2 e 5% CO2).
- Use dois tipos de sondas MEA: 6 x 10 MEA planar e 8 x 8 MEA. A primeira sonda cobre a região que compreende o córtex, o estriado e o tálamo. A última sonda cobre apenas a região cortical.
- Use um amplificador de 60 canais com um filtro passa-banda definido entre 0.1 Hz e 3 kHz a 1,200 amplificação. Adquira dados a uma taxa de amostragem de 10 kHz.
- Coloque dois fios de prata revestidos com AgCl dentro da câmara MEA para DCS. Use os fios de prata revestidos com AgCl para produzir campos elétricos gerados por um estimulador isolado.
- Coloque um eletrodo de tungstênio (diâmetro, 127 μm; comprimento, 7,62 cm; ponta cônica de 8 ° AC; resistência, 5 MΩ) para estimulação talâmica e coloque o eletrodo de referência na câmara MEA. Forneça as correntes do eletrodo de tungstênio usando um estimulador isolado que é controlado por um gerador de pulso.
2. Preparação da fatia do cérebro
- Use camundongos C57BL / 6J machos, 4-8 semanas de idade. Alojar os animais em uma sala com ar condicionado (21-23 °C; 50% de umidade; ciclo claro/escuro de 12 horas/12 horas, luzes acesas às 8:00 da manhã) com acesso gratuito a comida e água.
- Pegue uma alíquota de 250 ml do aCSF que foi preparada na Etapa 1.1 e coloque-a em um béquer que contenha gelo. Ao mesmo tempo, forneça gás contínuo composto por 95% de O2 e 5% de CO2.
- cirurgia
- Anestesiar o animal com isoflurano a 4% em uma caixa de vidro por aproximadamente 3 min. Quando o animal atingir uma profundidade cirúrgica de anestesia (indicada pela falta de resposta ao beliscão do dedo do pé), coloque-o em uma bandeja rasa cheia de gelo picado e remova a cabeça usando uma tesoura.
- Exponha o crânio e corte o músculo restante. Em seguida, usando rongeurs, retire a superfície dorsal do crânio do cérebro. Apare os lados do crânio usando rongeurs. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos com uma solução de etanol a 75%.
- Usando uma espátula, corte os bulbos olfatórios e as conexões nervosas ao longo da superfície ventral do cérebro e remova o cérebro. Após a decapitação, transfira rapidamente o cérebro para um béquer cheio de aCSF oxigenado gelado.
- Preparação do MT-ACC Brain Slice
nota: Prepare fatias que contenham o caminho do MT para o ACC.
- Corte manualmente o bloco cerebral com dois cortes sagitais 2,0 mm laterais à linha média em cada hemisfério para exibir a anatomia subcortical. Em seguida, faça dois cortes angulares. Faça o primeiro corte transversal paralelo ao trato de fibras visíveis no estriado.
- Faça o segundo corte transversal da conexão entre o cerebelo e o córtex visual até o ponto médio entre a comissura anterior e o trato óptico que são ventrais e paralelos à via do talamolingulado.
- Prenda o bloco cerebral a uma placa angular (~ 120 °) com adesivo de cianoacrilato e faça um corte logo acima do ponto de virada do caminho. Desdobre a placa, alise-a e cole-a no estágio da câmara de um vibratome.
- Faça fatias de cérebro de tálamo-ACC medial (500 μm de espessura) e, em seguida, mergulhe-as em aCSF oxigenado gelado. Transferir as fatias para a câmara de registo e manter a 32 °C sob perfusão contínua (12 ml/min) com aCSF oxigenado durante 1 hora.
3. Preparação da Câmara de Perfusão para Gravação de Multieletrodos
- Preparação da Câmara de Perfusão
- Coloque uma sonda MEA em um sistema multicanal e use dois tubos de polietileno separados para conectar a sonda a uma bomba peristáltica. Use um tubo para guiar o aCSF para dentro da câmara MEA e o outro tubo para guiar o aCSF para fora da câmara. Por fim, perfundir continuamente a preparação com aCSF oxigenado quente (29-30 °C) (8 ml/min).
- Transfira a fatia do cérebro para MEA. Segure a fatia do cérebro no MEA usando um cotonete úmido. Mova cuidadosamente a fatia do cérebro para garantir que o ACC esteja orientado acima dos eletrodos.
- Use kits de ancoragem de fatia e retenções para pressionar a fatia do cérebro. Esta etapa garante uma boa conexão elétrica entre a fatia e os eletrodos.
4. Geração de Campos Elétricos por DCS
Nota: A definição da orientação do campo elétrico foi baseada na direção do eixo axodendrítico no ACC. As orientações dos compartimentos dendrítico e soma foram confirmadas usando a coloração de Golgi.
- Coloque o eletrodo de AgCl (definido como ânodo) proximal ao ACC e coloque o outro eletrodo (definido como o cátodo) distal ao ACC. Registre a intensidade do campo que é gerada pelas duas orientações de campo (paralela e perpendicular às fibras axodendríticas do ACC) pelo MEA e forneça as correntes dos campos elétricos usando um estimulador.
- Fixe a distância dos eletrodos de AgCl (cerca de 1,5-2 cm) e ajuste a força da corrente do estimulador para tornar o DCS entre 0,5 e 2 mA.
5. Respostas sinápticas corticais induzidas eletricamente
Nota: Induza respostas sinápticas no ACC por estimulação elétrica no MT, no qual um gerador de estímulo elétrico programável produz pulsos de corrente bifásicos retangulares.
- Repita a Seção 3 acima.
- Coloque um eletrodo de tungstênio no MT e forneça pulsos do estimulador para a região talâmica das fatias por meio de eletrodos bipolares de tungstênio.
- Use várias intensidades de corrente para determinar o limite que provoca uma resposta ACC. Aqui, use uma intensidade de ±150 μA e duração de 200 μs, que provocou uma resposta máxima de 80% no ACC na maioria dos cortes.
- Mova o eletrodo de tungstênio ao longo da via do talamingulado (de MT para o corpo caloso) na fatia MT-ACC para obter os perfis de resposta ideais.
- Faça de 10 a 20 varreduras de respostas do ACC e use o software para calcular automaticamente a média de todos os ACC evocados pela estimulação MT. O resultado são as respostas sinápticas no ACC induzidas pela estimulação MT pela via MT-ACC.
6. Atividade semelhante a convulsão induzida eletricamente
Nota: A atividade convulsiva foi induzida pela aplicação de 4-aminopiridina (4-AP; 250 μM) e bicuculina (5 μM). Estudos anteriores de controle de tempo mostraram que as respostas máximas e estáveis apareceram 2-3 horas após a aplicação do medicamento.
- Repita a Seção 5 acima.
- Adicione medicamentos à solução de perfusão. Use 4-AP (250 μM) e bicuculina (5 μM). Misture os medicamentos uniformemente e continue a perfusão por 2-3 horas.
- Para facilitar a atividade semelhante a uma convulsão, mantenha a bomba de perfusão a uma taxa de perfusão relativamente rápida (8 ml/min), o que também pode ajudar a prevenir o acúmulo de um gradiente de pH.
- Coloque um eletrodo de tungstênio no MT e forneça estimulação elétrica (150 μA, duração de 200 μs) para obter perfis de resposta ACC.
- Faça de 10 a 20 varreduras e calcule a média das respostas.
- Substitua a solução de perfusão por aCSF fresco para lavar os medicamentos. Repita a Etapa 6.5.
7. Testando o efeito da DCS nas respostas corticais evocadas
- Repita as seções 3 e 4. Certifique-se de que campos elétricos uniformes sejam gerados pela passagem de correntes entre dois fios de prata revestidos com AgCl paralelos que são colocados dentro da câmara MEA. Se não houver problemas, o DCS permanece entre 0,5 e 2 mA.
- Desligue o DCS e coloque um eletrodo de tungstênio para estimular o tálamo (±150 μA, duração de 200 μs). Para obter respostas sinápticas máximas no ACC, faça 10-20 varreduras e calcule a média das respostas.
- Ligue simultaneamente o DCS (força DCS de 2 mV / mm) e a estimulação talâmica (350 μA, duração de 200 μs). Avalie as mudanças de amplitude da resposta ACC evocada por estimulação talâmica durante a DD.
- Desligue o DCS e adicione 4-AP (250 μM) e bicuculina (5 μM) à solução de perfusão. Em seguida, espere 2-3 horas. Quando as drogas afetam a fatia do cérebro, a fatia produz respostas de convulsão cortical.
- Faça 10-20 varreduras de respostas ACC e, em seguida, meça a amplitude e a duração das respostas de convulsão cortical evocadas elétricas.
- Após a etapa 7.5, ligue simultaneamente o DCS (força DCS de 2 mV / mm) e a estimulação talâmica (150 μA, 200 μs de duração). Avalie as mudanças na amplitude e duração das respostas de convulsões corticais evocadas durante a aplicação de DCS.
- Substitua a solução de perfusão por aCSF fresco para lavar os medicamentos e repita as etapas 7.2 e 7.3.
- Colete todos os dados de registro e agrupe os dados nas diferentes condições experimentais. Avaliar a amplitude e a duração das respostas às crises corticais em diferentes condições experimentais.
