Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação e cultura de fatias organotípicas do hipocampo
NOTA: Este protocolo permite a produção de fatias organotípicas do hipocampo. Idealmente, não mais do que três animais devem ser sacrificados e dissecados em uma sessão para garantir que cada etapa seja feita rapidamente e evitar comprometer a qualidade das fatias. Use uma técnica asséptica em todo o processo.
- Certifique-se de que as etapas a seguir sejam executadas antes de iniciar o protocolo de dissecção.
- Prepare e filtre e esterilize todas as soluções com antecedência usando um filtro de 0.22 μm.
- Manter as soluções a 4 °C durante a conservação e durante toda a dissecção do cérebro e preparação das fatias do hipocampo, mantendo sempre os recipientes de armazenagem e as placas de Petri num dissipador de calor metálico sobre gelo húmido.
- Autoclave todos os instrumentos de metal, anéis e lenços de papel.
- Certifique-se de que todos os instrumentos e materiais a serem usados para cada etapa do protocolo estejam prontos para uso, dispostos com antecedência e pulverizados com etanol a 70%. Em seguida, deixe-os esfriar e secar.
- Eutanasiar um filhote de camundongo C57BL / 6N de 5 a 7 dias de idade por luxação cervical e limpar brevemente toda a superfície da pele com tecido de papel estéril embebido em etanol a 70%. Seque a pele e decapite o filhote usando uma tesoura Mayo.
- Corte a pele do couro cabeludo com uma tesoura de íris ao longo da linha média da cabeça, começando na região occipital e terminando perto do focinho, e retraia-a lateralmente.
- Insira a ponta da tesoura de Vannas no forame magno e faça dois pequenos cortes laterais no osso ao longo dos seios transversos, depois corte o crânio ao longo da linha média até o bulbo olfatório e faça dois pequenos cortes perpendiculares à linha média nesta região.
- Usando uma pinça curva de ponta fina, retraia os retalhos do osso lateralmente para longe da linha média. Remova cuidadosamente o cérebro com uma pequena espátula e transfira-o para uma placa de Petri revestida com elastômero de silicone de 90 mm contendo um "meio de dissecação"
nota: O meio de dissecção é a solução salina balanceada de Gey (5 mg/mL de D-glicose, solução antibiótico-antimicótica a 1%, 10.000 unidades/mL de penicilina, 10 mg/mL de estreptomicina e 25 μg/mL de anfotericina B).
- Remova o cerebelo e separe os hemisférios cerebrais ao longo da linha média usando uma lâmina de barbear. Use uma espátula para transferir os hemisférios cerebrais para uma nova placa de Petri revestida com elastômero de silicone de 90 mm preenchida com meio de dissecção fresco e gelado. Se mais de um animal for usado em uma sessão, repita as etapas 1.2 a 1.6.
- Sob um estereomicroscópio, corte o bulbo olfatório e a ponta do córtex frontal com uma lâmina de barbear e separe o córtex cerebral do resto do tecido cerebral usando uma pinça de ponta fina. Esta etapa deixa o hipocampo exposto na superfície medial do tecido cortical. A partir desta etapa, use uma capa de cultura de tecidos de fluxo laminar (esterilizada por ultravioleta e limpa com uma solução de etanol a 70%).
- Aplique o meio de dissecção gelado em um disco de corte de plástico plano e, usando uma espátula, posicione o tecido cerebral no disco de forma que a superfície medial do córtex fique voltada para cima e o eixo do hipocampo seja perpendicular ao eixo da lâmina de corte.
- Remova o meio de dissecção do disco de corte o máximo possível usando uma pipeta Pasteur de ponta fina.
- Corte o cérebro em fatias de 400 μm usando um picador de tecidos a uma velocidade e força de corte de 50%.
nota: Esta etapa deve ser concluída o mais rápido possível, pois o tecido cerebral não fica submerso no meio de dissecação.
- Substitua o meio de dissecção na placa de Petri revestida com elastômero de silicone pelo meio fresco gelado.
- Quando o picador de tecidos estiver concluído, mergulhe cuidadosamente o tecido cerebral em um meio de dissecção fresco e transfira o tecido cortado de volta para a placa de Petri revestida com elastômero de silicone de 90 mm usando um bisturi de lâmina reta.
- Sob um estereomicroscópio, separe cuidadosamente as fatias corticais usando uma pinça de ponta fina. Para cada fatia, inspecione o hipocampo quanto à morfologia e possíveis danos teciduais resultantes da dissecção ou fatiamento.
- Separe o hipocampo do córtex entorrinal e da fímbria usando uma pinça de ponta fina e uma pequena tesoura de Vannas. Normalmente, cerca de 6 a 8 fatias do hipocampo são geradas por hemisfério.
- Transfira até 6 fatias de hipocampo para uma inserção de cultura de tecidos usando uma pipeta Pasteur cortada e coloque-a dentro de uma placa de Petri de 35 mm. Certifique-se de que as fatias estejam espalhadas a alguns milímetros de distância (isso garantirá que cada fatia possa ser visualizada individualmente).
- Adicione imediatamente um "meio de crescimento" gelado ao fundo de cada placa de Petri, sob a inserção de cultura de tecidos, logo abaixo da parte superior da borda da inserção de cultura de tecidos.
nota: O meio de crescimento contém 50% de meio essencial mínimo Eagle, 25% de solução salina balanceada de Hanks, 25% de soro de cavalo, 5 mg/mL de D-glicose, 2 mmol/L de L-glutamina, 1% de solução antibiótico-antimicótica e 10 mmol/L de ácido HEPES (4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico), titulado a pH 7,2 com hidróxido de sódio.
- Troque o meio de crescimento no dia seguinte à dissecção e a cada 2 a 3 dias depois disso (use o meio de crescimento a 37 °C). Certifique-se de que o meio de crescimento seja adicionado o suficiente, mas não tanto a ponto de transbordar sobre a membrana da inserção da cultura de tecidos, o que pode comprometer a viabilidade das fatias de tecido.
- Antes de serem usados em experimentos, mantenha as fatias de tecido em uma incubadora umidificada a 37 ° C com 5% de dióxido de carbono no ar por 12 a 14 dias.
2. Preparação das Fatias Organotípicas do Hipocampo para o Protocolo Experimental Blast TBI
NOTA: As etapas desta seção, exceto a imagem, ocorrem em uma capela de cultura de tecidos de fluxo laminar.
- Insira os anéis de aço inoxidável feitos sob medida em uma placa de 6 poços (um por poço).
NOTAS: Os anéis têm um aro com entalhe (que deve ficar na posição de 12 horas) e se encaixam perfeitamente dentro dos poços, enquanto as inserções de cultura de tecidos se encaixam facilmente neste aro. Certifique-se de que os anéis sejam lavados com um desinfetante bactericida, bem enxaguados com água purificada, autoclavados e deixados esfriar com antecedência.
- Encher o poço da placa de 6 poços com "meio experimental" pré-aquecido (37 °C) isento de soro com iodeto de propídio.
nota: O meio experimental com iodeto de propídio é 75% de meio essencial mínimo Eagle, 25% de solução salina balanceada de Hanks, 5 mg/mL de D-glicose, 2 mmol/L de L-glutamina, 1% de solução antibiótica, 10 mmol/L de HEPES e 4,5 μmol/L de iodeto de propídio, pH titulado a 7,2 com hidróxido de sódio.
- Certifique-se de que o nível médio não ultrapasse o entalhe do anel. Transfira a placa de 6 poços com os anéis de volta para a incubadora por 1 h para garantir que o meio esteja a 37 ° C imediatamente antes da transferência das inserções de cultura de tecidos.
- Transferir as inserções de cultura de tecidos com as fatias organotípicas das placas de Petri de 35 mm para a placa de 6 poços com os anéis e o meio experimental com uma pinça.
- Faça um ponto na borda da pastilha na posição de 3 horas com uma caneta marcadora permanente.
nota: As pastilhas serão removidas da placa de 6 poços durante o experimento. Esta etapa facilita o retorno do inserto à sua posição original após a exposição à onda de choque e acompanha facilmente cada fatia ao longo do protocolo.
- Rotule cada placa de 6 poços com um nome e data exclusivos e faça um mapa dos poços de cada placa, nomeando cada poço (por exemplo, A, B, C, etc.) e cada fatia em cada poço (por exemplo, 1, 2, 3, etc.), para que cada fatia tenha um identificador único (por exemplo, A1, A2, A3, etc.).
- Transfira a placa de 6 poços para a incubadora por 1 h imediatamente antes da imagem para garantir que as fatias estejam a 37 °C.
nota: Evite transbordar meio ou bolhas de ar sob a membrana da inserção de cultura de tecidos, o que pode comprometer a viabilidade das fatias.
- 1 h após a transferência para o meio experimental, crie imagens de cada fatia individualmente usando um microscópio de fluorescência (objetiva 2X, NA 0,06) equipado com um filtro apropriado de excitação (BP 535/50 nm) e emissão (LP 610 nm) para avaliar a saúde do corte antes que o protocolo de lesão seja realizado.
anotações: As fatias que exibem áreas de coloração vermelha densa nesta fase devem ser consideradas como apresentando viabilidade comprometida e devem ser excluídas de análises posteriores (normalmente representam menos de 10% do número total de fatias geradas). Certifique-se de que a imagem seja realizada sequencialmente e o mais rápido possível para minimizar o tempo que as fatias ficam fora da incubadora (normalmente 6 poços devem levar pouco menos de 30 minutos para obter a imagem).
- Mantenha a tampa da placa de 6 poços sempre colocada. Alguma condensação pode se acumular no interior da tampa. Se isso acontecer, use brevemente um secador de cabelo na configuração baixa.
- Certifique-se de que todas as condições de imagem sejam idênticas em dias diferentes e entre experimentos.
nota: O objetivo da imagem é quantificar a fluorescência tecidual; portanto, essa etapa é importante para garantir a reprodutibilidade dos resultados e permitir a comparação dos dados.
3. Submersão e Transporte das Inserções de Cultura de Tecidos com as Fatias Organotípicas do Hipocampo
- Imediatamente após a imagem, em uma capela de fluxo laminar, uma cultura de tecido é retirada da placa de 6 poços usando uma pinça.
- Transfira cuidadosamente o inserto para um saco de polietileno estéril (3" x 5") pré-preenchido com 20 mL de meio experimental quente (37 °C) recém-borbulhado com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono.
nota: Certifique-se de que o meio experimental enriquecido com oxigênio e dióxido de carbono foi borbulhado por pelo menos 40 min com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono usando um borbulhador de vidro estilhaçado dentro de uma garrafa Dreschel e transferido para os sacos de polietileno estéril dentro de uma capa de cultura de tecidos de fluxo laminar usando uma seringa de 20 mL com um filtro bacteriano e um tubo de enchimento estéril (127 mm) conectado. Selar imediatamente os sacos e transferi-los para uma incubadora a 37 °C durante pelo menos 1 h antes da transferência da inserção da cultura de tecidos.
- Certifique-se de que cada saco estéril esteja corretamente rotulado (com a identificação da placa e do poço). Repita esta etapa para cada inserção de cultura de tecidos. Exclua cuidadosamente as bolhas de ar ao selar os sacos estéreis (feito com segurança, girando a parte superior dos sacos e aplicando uma braçadeira de plástico).
- Retorne os sacos estéreis com as inserções de cultura de tecidos e as placas de 6 poços com meio experimental na incubadora a 37 °C.
- Após 1 h, embale cuidadosamente os sacos estéreis com as inserções de cultura de tecidos em caixas plásticas dentro de uma caixa termorregulada cheia de água desionizada a 37 ° C para manter as fatias organotípicas em temperatura fisiológica durante todo o protocolo de exposição à onda de choque.
4. Preparação do tubo de choque e da exposição à onda de choque do corte organotípico do hipocampo
- Use botas de proteção com biqueira de aço, jaleco de laboratório e luvas enquanto prepara o tubo de choque e expõe a onda de choque.
- Aparafuse a estrutura do suporte da bolsa estéril ao flange distal do tubo de choque, certificando-se de que o orifício central esteja alinhado com a saída do tubo de choque (usando uma haste cega).
- Monte dois transdutores de pressão radialmente: sensor 1 na parte central da seção acionada e sensor 2 no flange distal do tubo de choque (Figura 1A). Conecte os transdutores de pressão a um osciloscópio por meio de uma unidade de alimentação de fonte de corrente.
- Certifique-se de que todas as válvulas de liberação do tubo de choque e controles de fluxo estejam fechados.
- Abra a linha externa de ar comprimido e carregue a válvula solenóide a 2,5 bar.
- Abra a válvula de segurança do cilindro de ar comprimido e abra lentamente o regulador de pressão para aumentar a pressão para aproximadamente 5 bar.
NOTA: A pressão definida para este regulador deve estar ligeiramente acima da pressão de ruptura do diafragma mais alta.
- Prepare os diafragmas cortando folhas de poliéster de 23 μm de espessura em quadrados de 10 x 10 cm2. Prepare as alças usando fita adesiva de autoclave e cole-as na parte superior e inferior de cada diafragma.
- Posicione um diafragma (ranhura única da culatra dupla - configuração de diafragma único) ou dois diafragmas (ambas as ranhuras da culatra dupla - configuração de diafragma duplo) na culatra (Figura 1B).
- Centralize os diafragmas e prenda-os usando quatro parafusos e porcas M24, fixando-os sequencialmente de forma diagonalmente simétrica e garantindo que os diafragmas estejam sem rugas.
- Prenda cada bolsa estéril individualmente na posição vertical na estrutura do suporte, garantindo que a superfície das inserções de cultura de tecidos com as fatias organotípicas do hipocampo esteja voltada para a saída do tubo de choque e a inserção de cultura de tecidos esteja centralizada dentro da bolsa estéril (Figura 1C). Certifique-se de que a bolsa estéril esteja bem presa ao redor para garantir uma imobilização firme e uniforme.
- Use protetores auriculares e óculos de segurança ao pressionar o tubo de choque. Ligue a fonte de alimentação atual e o osciloscópio para adquirir os dados da onda de choque (taxa de aquisição de 50 mega-samples/s, comprimento recorde de 20 ms, 1 milhão de pontos) e feche a válvula solenóide.
- Usando o botão de controle de fluxo no painel de controle do tubo de choque, pressurize lentamente a seção de volume do acionador do tubo de choque para configuração de diafragma único ou a seção de volume do acionador e a seção de culatra dupla do tubo de choque para configuração de diafragma duplo.
nota: Para a configuração de diafragma único, a pressão de ruptura dependerá apenas do material e da espessura do diafragma, e o diafragma se romperá espontaneamente assim que a pressão de ruptura do material for atingida. Para a configuração de diafragma duplo, a pressão de ruptura também dependerá do diferencial de pressão do gás nas câmaras do acionador e da culatra dupla, e para que os diafragmas estourem de forma controlada, a válvula de segurança da culatra dupla é aberta manualmente assim que as pressões alvo são atingidas.
- Assim que o diafragma se romper (produzindo um ruído alto), feche rapidamente o fluxo de ar comprimido usando o botão de fluxo e abra a válvula solenóide.
nota: O volume total da seção do acionador pode ser modificado pela inserção de segmentos de blanking, permitindo obter uma faixa mais ampla de sobrepressão e durações de pico de ondas de choque. A combinação ideal de parâmetros de ondas de choque deve ser suficiente para causar lesão tecidual, mas não tão alta que cause a inserção da cultura de tecidos ou distorção ou ruptura do saco estéril.
- Exponha cada bolsa estéril com cultura de tecidos, insira-a em uma única onda de tubo de choque e devolva-a imediatamente à caixa termorregulada antes que uma nova bolsa estéril seja retirada da caixa e presa na estrutura do suporte. Certifique-se de que as etapas 4.10 a 4.14 sejam executadas da maneira mais suave e rápida possível (dentro de alguns minutos) para evitar que o meio experimental esfrie, pois temperaturas abaixo de 37 ° C podem interferir no desenvolvimento de lesões.
- Uma vez que todas as inserções de cultura de tecidos tenham sido expostas a uma onda de choque (ou protocolo simulado), devolva-as à placa original de 6 poços e seu respectivo poço (dentro de uma capela de cultura de tecidos de fluxo laminar) e retorne à incubadora.
- Mantenha a placa de 6 poços na incubadora com 5% de dióxido de carbono no ar a 37 °C até nova imagem.
- Inclua controles simulados para cada experimento e a exposição à onda de choque da fatia.
nota: As fatias simuladas são tratadas de forma idêntica às fatias expostas a uma onda de choque (seladas nos sacos estéreis com meio experimental, transportadas para o laboratório de tubos de choque na mesma caixa termorregulada e suspensas na estrutura metálica por um período de tempo equivalente), mas o tubo de choque não é disparado.
